CN102112604A - 具有乙酰木聚糖酯酶活性的多肽和编码该多肽的多核苷酸 - Google Patents

Abstract

本发明涉及具有乙酰木聚糖酯酶活性的分离的多肽和编码该多肽的分离的多核苷酸。本发明还涉及包含所述多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞以及产生和使用所述多肽的方法。

Description

具有乙酰木聚糖酯酶活性的多肽和编码该多肽的多核苷酸

涉及序列表

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涉及生物材料保藏物

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发明背景

发明领域

本发明涉及具有乙酰木聚糖酯酶活性的分离的多肽和编码该多肽的分离的多核苷酸。本发明还涉及包含所述多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞，以及产生和使用所述多肽的方法。

相关技术描述

植物细胞壁多糖构成植物细胞壁的90％并且能够分成以下三组：纤维素、半纤维素和果胶。纤维素是细胞壁多糖的主要成分。半纤维素是植物细胞壁中第二丰富的成分。主要的半纤维素聚合物是木聚糖。植物细胞壁中存在的木聚糖的结构取决于它们的来源可能差异显著，但是它们总是含有β-1，4-连接的D-木糖主链。β-1，4-连接的D-木糖主链能够用多个侧基取代，所述侧基如L-阿拉伯糖基(L-arabinosyl)、D-半乳糖基、乙酰基、阿魏酰基(feruloyl)、对-香豆酰基(p-coumaroyl)和葡糖醛酸基残基。

木聚糖主链的生物降解依赖于两类酶：内切木聚糖酶和β-木糖苷酶。内切木聚糖酶(EC 3.2.1.8)将木聚糖主链切割成较小的寡糖，这些寡糖能够进一步通过β-木糖苷酶(EC 3.2.1.37)降解成木糖。其他涉及木聚糖降解的酶包括，例如，乙酰木聚糖酯酶、阿拉伯糖酶、α-葡糖醛酸糖苷酶、阿魏酸酯酶和对-香豆酸酯酶。

乙酰木聚糖酯酶(EC 3.1.1.6)从乙酰木聚糖的β-D-吡喃木糖基残基(β-D-xylopyranosyl residue)上的2位和/或3位去除O-乙酰基。乙酰木聚糖在木聚糖的水解中发挥重要作用，因为所述乙酰侧基能够在空间上干扰切割主链的酶的接近。乙酰侧基的去除促进内切木聚糖酶的作用。基于序列相似性的糖酯酶分类体系产生了对13个家族的定义，其中的七个含有乙酰木聚糖酯酶(Henrissat B.，1991，Biochem.J.280：309-316，以及Henrissat和Bairoch，1996，Biochem.J.316：695-696)。

Margolles-Clark等，1996，Eur.J.Biochem.237：553-560公开了来自里氏木霉(Trichoderma reesei)的乙酰木聚糖酯酶。Sundberg和Poutanen，1991，Biotechnol.Appl.Biochem.13：1-11公开了里氏木霉的两种乙酰木聚糖酯酶的纯化和性质。WO 2005/001036公开了来自里氏木霉的乙酰木聚糖酯酶基因。美国专利5,681,732号公开了来自黑曲霉(Aspergillus niger)的乙酰木聚糖酯酶基因。美国专利5,763,260号公开了改变乙酰化木聚糖的性质的方法。

本发明涉及具有乙酰木聚糖酯酶活性的多肽和编码所述多肽的多核苷酸。

发明内容

本发明涉及选自下组的具有乙酰木聚糖酯酶活性的分离的多肽：

(a)包含与SEQ ID NO：2的成熟多肽具有至少75％同一性的氨基酸序列的多肽；

(b)由如下多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸在至少中等-高严格条件下与SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列或其全长互补链杂交；

(c)由如下多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸包含与SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列具有至少75％同一性的核苷酸序列；和

(d)包含取代、缺失和/或插入一个或多个(几个)氨基酸的SEQ ID NO：2的成熟多肽的变体。

本发明还涉及选自下组的分离的多核苷酸，其编码具有乙酰木聚糖酯酶活性的多肽：

(a)一种多核苷酸，其编码包含与SEQ ID NO：2的成熟多肽具有至少75％同一性的氨基酸序列的多肽；

(b)一种多核苷酸，其在至少中等-高严格条件下与SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列或其全长互补链杂交；

(c)一种多核苷酸，其包含与SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列具有至少75％同一性的核苷酸序列；和

(d)一种多核苷酸，其编码一种变体，该变体包含取代、缺失和/或插入一个或多个(几个)氨基酸的SEQ ID NO：2的成熟多肽。

本发明还涉及包含所述多核苷酸的核酸构建体、重组表达载体和重组宿主细胞，并涉及产生具有乙酰木聚糖酯酶活性的多肽的方法。

本发明还涉及抑制细胞中具有乙酰木聚糖酯酶活性的多肽表达的方法，包括向所述细胞施用或在所述细胞中表达双链RNA(dsRNA)分子，其中所述dsRNA包含本发明的多核苷酸的亚序列。本发明还涉及这样的双链抑制性RNA(dsRNA)分子，其中任选地所述dsRNA是siRNA或miRNA分子。

本发明还涉及包含编码具有乙酰木聚糖酯酶活性的多肽的分离多核苷酸的植物。

本发明还涉及产生具有乙酰木聚糖酯酶活性的多肽的方法，包括：(a)在有助于下述多肽产生的条件下，培养转基因植物或植物细胞，所述转基因植物或植物细胞包含编码所述具有乙酰木聚糖酯酶活性的多肽的多核苷酸；和(b)回收所述多肽。

本发明还涉及使用具有乙酰木聚糖酯酶活性的多肽以供降解或转化含木聚糖材料或纤维素材料的方法。

本发明还涉及编码信号肽的分离多核苷酸，所述信号肽包含SEQ IDNO：2的氨基酸1至15，或由SEQ ID NO：2的氨基酸1至15组成；涉及包含所述多核苷酸的核酸构建体、表达载体和重组宿主细胞；以及涉及产生蛋白质的方法。

附图简述

图1显示嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)CBS 117.65CE5乙酰木聚糖酯酶的基因组DNA序列和推导的氨基酸序列(分别为SEQ ID NOs：1和2)。

图2显示pThihe117AXE1的限制图谱。

图3显示pMMar11的限制图谱。

定义

乙酰木聚糖酯酶活性：术语“乙酰木聚糖酯酶活性”在本文中定义为羧基酯酶活性(EC 3.1.1.72)，其催化乙酰基从聚合木聚糖、乙酰化木糖、乙酰化葡萄糖、α-乙酸萘酯、乙酸对硝基苯酯(p-nitrophenyl acetate)的水解。就本发明而言，乙酰木聚糖酯酶活性是按照实施例中描述的方法测定的。一个单位的乙酰木聚糖酯酶活性定义为能够在pH 5，25℃每分钟释放1μmol对硝基苯酚阴离子(p-nitrophenolate anion)的酶量。

本发明的多肽具有SEQ ID NO：2的成熟多肽的乙酰木聚糖酯酶活性的至少20％，优选至少40％，更优选至少50％，更优选至少60％，更优选至少70％，更优选至少80％，甚至更优选至少90％，最优选至少95％，并且甚至最优选至少100％。

家族5羧基酯酶(carboxyesterase)：术语“家族5糖酯酶”或“家族GE5”或“GE5”在本文中定义为根据Coutinho，P.M.&Henrissat，B.(1999)Carbohydrate-active enzymes：an integrated database approach.In″RecentAdvances in Carbohydrate Bioengineering″，H.J.Gilbert，G.Davies，B.Henrissatand B.Svensson eds.，The Royal Society of Chemistry，Cambridge，pp.3-12属于糖酯酶家族的多肽。

木聚糖降解活性：术语“木聚糖降解活性”或“木聚糖分解活性”在本文中定义为降解含木聚糖材料的生物学活性。两种测定木聚糖分解活性的基础方法包括：(1)测定总木聚糖分解活性，和(2)测定单独的木聚糖分解活性(内切木聚糖酶、β-木糖苷酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、α-葡糖醛酸糖苷酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶和α-葡糖醛酸酯酶)。最近在木聚糖分解酶测定法的进展总结于几个公开文献中，包括Biely和Puchard，Recent progress in the assaysof xylanolytic enzymes，2006，Journal of the Science of Food and Agriculture86(11)：1636-1647；Spanikova和Biely，2006，Glucuronoyl esterase-Novelcarbohydrate esterase produced by Schizophyllum commune，FEBS Letters580(19)：4597-4601；Herrmann，Vrsanska，Jurickova，Hirsch，Biely和Kubicek，1997，The beta-D-xylosidase of Trichoderma reesei is a multifunctionalbeta-D-xylan xylohydrolase，Biochemical Journal 321：375-381。

总木聚糖降解活性可通过确定从多种类型的木聚糖形成的还原糖来测定，所述木聚糖包括燕麦小麦(oat spelt)、山毛榉木(beechwood)和落叶松木(larchwood)木聚糖，或者可通过光度法确定从多种共价染色的木聚糖释放出的染色的木聚糖片段来测定。最常见的总木聚糖分解活性测定法基于从多聚的4-O-甲基葡糖醛酸木聚糖产生还原糖，如Bailey，Biely，Poutanen，1992，Interlaboratory testing of methods for assay of xylanase activity，Journal ofBiotechnology 23(3)：257-270中所述。

就本发明而言，木聚糖降解活性是通过测定由木聚糖降解酶在下述通常条件下造成的桦木木聚糖(Sigma Chemical Co.，Inc.，St.Louis，MO，USA)水解的增加来确定的：1ml反应液，5mg/ml底物(总固形物)，5mg木聚糖分解蛋白质/g底物，50mM乙酸钠，pH 5，50℃，24小时，如Lever，1972，A newreaction for colorimetric determination of carbohydrates，Anal.Biochem 47：273-279所述使用对羟基苯甲酸酰肼(PHBAH)测定法进行糖分析。

木聚糖酶活性：术语“木聚糖酶活性”在本文中定义为1，4-β-D-木聚糖-木聚糖水解酶活性(E.C.3.2.1.8)，其催化木聚糖中1，4-β-D-木糖苷键的内水解。就本发明而言，木聚糖酶活性是使用桦木木聚糖作为底物确定的。一个单位的木聚糖酶活性定义为在50℃，pH 5从每升2g桦木木聚糖作为底物在50mM乙酸钠，0.01％

20中水解的起始期间每分钟产生1.0μmol还原糖(以葡萄糖当量(glucose equivalents)测定，如Lever，1972，A new reaction forcolorimetric determination of carbohydrates，Anal.Biochem 47：273-279所述)。

β-木糖苷酶活性：术语“β-木糖苷酶活性”在本文中定义为β-D木糖苷木糖水解酶(E.C.3.2.1.37)，其催化短β(1→4)木寡糖(xylooligosaccharide)的外水解以从非还原端去除连续的D-木糖残基。就本发明而言，一个单位的β-木糖苷酶活性定义为在40℃，pH 5从1mM对硝基苯基-β-D-木糖苷作为底物在100mM柠檬酸钠，0.01％20中每分钟产生1.0μmol对硝基苯酚。

纤维素分解活性：术语“纤维素分解活性”在本文中定义为水解纤维素材料的生物学活性。测定纤维素分解活性的两种基本方法包括：(1)测定总纤维素分解活性，和(2)测定单独的纤维素分解活性(内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶)，如Zhang等，Outlook for cellulase improvement：Screening and selectionstrategies，2006，Biotechnology Advances 24：452-481所综述的。总纤维素分解活性通常是使用不溶性底物来测定的，所述底物包括Whatman No.1滤纸、微晶纤维素、细菌纤维素、藻类纤维素、棉花、经预处理的木素纤维素等。最常见的总纤维素分解活性测定法是使用Whatman No.1滤纸作为底物的滤纸测定法。该测定法是由International Union of Pure and Applied Chemistry(IUPAC)(Ghose，1987，Measurement of cellulase activities，Pure Appl.Chem.59：257-68)确立的。

就本发明而言，纤维素分解活性通过测定在下述条件下由纤维素分解酶进行的纤维素材料水解的增加来确定：1-20mg的纤维素分解蛋白/g的PCS中纤维素在50-65℃进行3-7日，与未添加纤维素分解蛋白的对照水解相比较。通常条件为：1ml反应液，经洗涤或未洗涤的PCS，5％不溶性固形物，50mM乙酸钠，pH 5，1mM MnSO₄，50-65℃，72小时，通过

HPX-87H柱(Bio-Rad Laboratories，Inc.，Hercules，CA，USA)进行糖分析。

内切葡聚糖酶：术语“内切葡聚糖酶”在本文中定义为内-1，4-(1，3；1，4)-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶(E.C.3.2.1.4)，其催化纤维素、纤维素衍生物(如羧甲基纤维素和羟乙基纤维素)、地衣淀粉中的1，4-β-D-糖苷键，混合型β-1，3-葡聚糖如谷物β-D-葡聚糖或木葡聚糖，以及其它含有纤维素成分的植物材料中β-1，4-键的内水解。内切葡聚糖酶活性可基于底物粘度的减少或通过还原糖测定法确定的还原端的增加来确定(Zhang等，2006，Biotechnology Advances 24：452-481)。就本发明而言，内切葡聚糖酶活性使用羧甲基纤维素(CMC)水解根据Ghose，1987，Pure and Appl.Chem.59：257-268的方法加以确定。

纤维二糖水解酶：术语“纤维二糖水解酶”在本文中定义为1，4-β-D-葡聚糖纤维二糖水解酶(E.C.3.2.1.91)，其催化纤维素、纤维寡糖、或任何含β-1，4-连接的葡萄糖的聚合物中1，4-β-D-葡糖苷键的水解，从链的还原端或非还原端释放纤维二糖(Teeri，1997，Crystalline cellulose degradation：New insight into thefunction of cellobiohydrolases，Trends in Biotechnology 15：160-167；Teeri等，1998，Trichoderma reesei cellobiohydrolases：why so efficient on crystalline cellulose？，Biochem.Soc.Trans.26：173-178)。就本发明而言，纤维二糖水解酶活性是依照van Tilbeurgh等，1982，FEBS Letters 149：152-156以及van Tilbeurgh和Claeyssens，1985，FEBS Letters 187：283-288所述的方法对荧光性二糖衍生物4-甲基伞形酮酰基-β-D-乳糖苷(4-methylumbelliferyl-β-D-lactoside)确定的。

β-葡糖苷酶：术语“β-葡糖苷酶”在本文中定义为β-D-葡糖苷葡糖水解酶(E.C.3.2.1.21)，其催化末端非还原性β-D-葡萄糖残基的水解，并释放β-D-葡萄糖。就本发明而言，β-葡糖苷酶活性是根据Venturi等，2002，Extracellularbeta-D-glucosidase from Chaetomium thermophilum var.coprophilum：production，purification and some biochemical properties，J.Basic Microbiol.42：55-66所述的基本方法来测定的，只是如本文所述使用了不同的条件。一个单位的β-葡糖苷酶活性定义为：在100mM柠檬酸钠、0.01％20中，在40℃、pH 5条件下从作为底物的1mM对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷每分钟产生1.0微摩尔对硝基苯酚。

纤维素分解增强活性：术语“纤维素分解增强活性”在本文中定义为下述生物学活性，即其增强具有纤维素分解活性的多肽对纤维素材料的水解。就本发明而言，纤维素分解增强活性通过测定由于纤维素分解蛋白对纤维素材料在下述条件下进行的水解造成的还原糖的增加或总纤维二糖和葡萄糖的增加来确定：1-50mg的总蛋白质/g的PCS中纤维素，其中总蛋白质包含50-99.5％w/w纤维素分解蛋白和0.5-50％w/w纤维素分解增强活性蛋白，在50-65℃进行1-7日，与具有相等的总蛋白质加载量但无纤维素分解增强活性的对照水解相比较(1-50mg的纤维素分解蛋白/g的PCS中纤维素)。在一个优选的方面，将在3％总蛋白质重量的米曲霉(Aspergillus oryzae)β-葡糖苷酶(根据WO 02/095014在米曲霉中重组产生)或3％总蛋白质重量的烟曲霉(Aspergillus fumtgatus)β-葡糖苷酶(根据WO 02/095014所述在米曲霉中重组产生)的纤维素酶蛋白加载量存在下的

1.5L(NovozymesA/S，Bagsvaerd，Denmark)的混合物用作所述纤维素分解活性的来源。

具有纤维素分解增强活性的多肽具有GH61多肽的成熟多肽的纤维素分解增强活性的至少20％，优选至少40％，更优选至少50％，更优选至少60％，更优选至少70％，更优选至少80％，甚至更优选至少90％，最优选至少95％，并且甚至最优选至少100％。

所述具有纤维素分解增强活性的多肽通过将达到同等水解程度所需的纤维素分解酶的量减少至少1.01倍，更优选至少1.05倍，更优选至少1.10倍，更优选至少1.25倍，更优选至少1.5倍，更优选至少2倍，更优选至少3倍，更优选至少4倍，更优选至少5倍，甚至更优选至少10倍，且最优选至少20倍来增强由具有纤维素分解活性的蛋白质催化的对纤维素材料的水解。

含木聚糖材料：术语“含木聚糖材料”在本文中定义为任何包含植物细胞壁多糖的材料，所述多糖包含β-(1-4)连接的木糖残基的主链。陆生植物的木聚糖是具有β-(1-4)-D-木吡喃糖(beta-(1-4)-D-xylopyranose)主链的杂聚物，其具有短糖链的分支。它们包含D-葡糖醛酸或其4-O-甲基醚，L-阿拉伯糖和/或多种寡糖，包括D-木糖、L-阿拉伯糖、D-或L-半乳糖和D-葡萄糖。木聚糖类型的多糖可分为同木聚糖(homoxylan)和杂木聚糖(heteroxylan)，后者包括葡糖醛酸木聚糖、(阿拉伯)葡糖醛酸木聚糖、(葡糖醛酸)阿拉伯木聚糖、阿拉伯木聚糖和复杂的杂木聚糖。参见，例如，Ebringerova等，2005，Adv.Polym.Sci.186：1-67。

在本发明的方法中，可使用任何含木聚糖的材料。在一个优选的方面，所述含木聚糖材料是木素纤维素。

纤维素材料：所述纤维素材料可以是任何含有纤维素的材料。生物质的初生细胞壁中主要的多糖是纤维素，丰度第二高的是半纤维素，第三是果胶。在细胞停止生长后产生的次生细胞壁也含有多糖，并且通过与半纤维素共价交联的多聚体木质素而加强。纤维素是脱水纤维二糖的均聚物，并因此是一种直链β-(1-4)-D-葡聚糖，而半纤维素包括多种化合物，如木聚糖、木葡聚糖、阿拉伯木聚糖和甘露聚糖，具有复杂的分枝结构和一系列取代基。虽然纤维素一般是无定形的，但植物组织中发现的纤维素主要为平行葡聚糖链的不溶性晶体基质。半纤维素通常通过氢键键合于纤维素以及其它半纤维素上，其有助于细胞壁基质的稳定化。

纤维素通常存在于例如植物的茎、叶、壳(hulls)、皮(husks)和穗轴(cobs)，或者树的叶、枝、和木材等之中。纤维素材料可以是，但不限于，草本材料(herbaceous material)、农业残余物(agricultural residues)、林业残余物(forestryresidues)、城市固体废物(municipal solid wastes)、废纸(waste paper)，以及纸浆和造纸厂残余物(pulp and paper mill residue)。(参见例如Wiselogel等，1995，于Handbook on Bioethanol(Charles E.Wyman编)，第105-118页，Taylor & Francis，Washington D.C.；Wyman，1994，Bioresource Technology 50：3-16；Lynd，1990，Applied Biochemistry and Biotechnology 24/25：695-719；Mosier等，1999，RecentProgress in Bioconversion of Lignocellulosics，于Advances in BiochemicalEngineering/Biotechnology，T.Scheper总编，第65卷，第23-40页，Springer-Verlag，New York)。在本文中应当理解，纤维素可为木素纤维素的形式，即在混合的基质中包含木质素、纤维素和半纤维素的植物细胞壁材料。在一个优选的方面，所述纤维素材料是木素纤维素。

在一方面，所述纤维素材料为草本材料。在另一方面，所述纤维素材料为农业残余物。在另一方面，所述纤维素材料为林业残余物。在另一方面，所述纤维素材料为城市固体废物。在另一方面，所述纤维素材料为废纸。在另一方面，所述纤维素材料为纸浆和造纸厂残余物。

在另一方面，所述纤维素材料为玉米秸秆。在另一方面，所述纤维素材料为玉米纤维。在另一方面，所述纤维素材料为玉米穗轴。在另一方面，所述纤维素材料为橙皮。在另一方面，所述纤维素材料为稻秆。在另一方面所述纤维素材料为麦秆。在另一方面，所述纤维素材料为柳枝稷(switch grass)。在另一方面，所述纤维素材料为芒草属(miscanthus)。在另一方面，所述纤维素材料为甘蔗渣。

在另一方面，所述纤维素材料是微晶纤维素。在另一方面，所述纤维素材料是细菌纤维素。在另一方面，所述纤维素材料是藻类纤维素。在另一方面，所述纤维素材料是棉线头(cotton linter)。在另一方面，所述纤维素材料是无定形的经磷酸处理的纤维素。在另一方面，所述纤维素材料是滤纸。

纤维素材料可以直接使用，或者可以使用本领域已知的常规方法(如本文中所述的)进行预处理。在一个优选的方面，所述纤维素材料经过预处理。

预处理玉米秸秆：术语“PCS”或“预处理的玉米秸秆”在本文中定义为通过用热和稀硫酸处理从玉米秸秆得到的纤维素材料。

分离的多肽：如本文使用的术语“分离的多肽”指从来源分离的多肽。在一个优选的方面，如通过SDS-PAGE测定的，所述多肽为至少1％纯，优选至少5％纯，更优选至少10％纯，更优选至少20％纯，更优选至少40％纯，更优选至少60％纯，甚至更优选至少80％纯，并且最优选至少90％纯。

基本上纯的多肽：术语“基本上纯的多肽”在本文表示多肽制备物，所述多肽制备物含有按重量计至多10％，优选至多8％，更优选至多6％，更优选至多5％，更优选至多4％，更优选至多3％，甚至更优选至多2％，最优选至多1％，并且甚至最优选至多0.5％的与其天然或重组结合的(associated)其它多肽材料。因此，优选所述基本上纯的多肽按存在于制备物中的全部多肽材料的重量计是至少92％纯，优选至少94％纯，更优选至少95％纯，更优选至少96％纯，更优选至少97％纯，更优选至少98％纯，甚至更优选至少99％纯，最优选至少99.5％纯，并且甚至最优选100％纯。本发明的多肽优选是基本上纯的形式，即所述多肽制备物基本上(essentially)不含与其天然或重组结合的其它多肽材料。例如，这能够通过如下实现：通过公知的重组方法或通过经典纯化方法制备多肽。

成熟多肽：术语“成熟多肽”在本文中定义为以其在翻译和任何翻译后修饰(如N-末端加工、C-末端截短、糖基化、磷酸化等)之后的最终形式存在的多肽。在一个方面，基于预测SEQ ID NO：2的氨基酸1至17是信号肽的SignalP程序(Nielsen等，1997，Protein Engineering 10：1-6)，所述成熟多肽是SEQ ID NO：2的氨基酸18至228。

成熟多肽编码序列：术语“成熟多肽编码序列”在本文中定义为编码具有乙酰木聚糖酯酶活性的成熟多肽的核苷酸序列。在一个方面，基于预测SEQID NO：1的核苷酸1-51编码信号肽的SignalP程序(Nielsen等，1997，见上文)，所述成熟多肽编码序列是SEQ ID NO：1的核苷酸52-885。

同一性：两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性由参数“同一性”来描述。

就本发明而言，两个氨基酸序列之间的同一性程度是使用如EMBOSS程序包(EMBOSS：The European Molecular Biology Open Software Suite，Rice等，2000，Trends in Genetics 16：276-277)(优选版本3.0.0或更新的版本)的Needle程序中执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970，J.Mol.Biol.48：443-453)来测定的。使用的可选参数是：缺口产生罚分为10，缺口延伸罚分为0.5，和EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。将标记为“最长同一性”的Needle输出(使用-nobrief选项获得)用作百分比同一性并且如下计算：

(相同的残基x 100)/(比对的长度-比对中的缺口总数)

就本发明而言，两个脱氧核糖核苷酸序列之间的同一性程度使用如EMBOSS程序包(EMBOSS：The European Molecular Biology Open SoftwareSuite，Rice等，2000，见上)(优选版本3.0.0或更新的版本)的Needle程序中执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970，见上)测定。使用的可选参数是：缺口产生罚分为10，缺口延伸罚分为0.5，和EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版本)取代矩阵。将标记为“最长同一性”的Needle输出(使用-nobrief选项获得)用作百分比同一性并且如下计算：

(相同的脱氧核糖核苷酸x 100)/(比对的长度-比对中的缺口总数)

同源序列：术语“同源序列”在本文中定义为用SEQ ID NO：2的嗜热毁丝霉乙酰木聚糖酯酶或其成熟多肽，在tfasty检索(Pearson，W.R.，1999，于Bioinformatics Methods and Protocols，S.Misener和S.A.Krawetz编，185-219页)中具有小于0.001的E值(或预期分数)的预测蛋白质。

多肽片段：术语“多肽片段”在本文定义为从SEQ ID NO：2的成熟多肽或其同源序列的氨基和/或羧基末端缺失了一个或多个(几个)氨基酸的多肽；其中所述片段具有乙酰木聚糖酯酶活性。在一个优选的方面，片段含有SEQID NO：2的成熟多肽或其同源序列的至少180个氨基酸残基，更优选至少190个氨基酸残基，并且最优选至少200个氨基酸残基。

亚序列：术语“亚序列(subsequence)”在本文中定义为从SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列的5′和/或3′端缺失了一个或多个(几个)核苷酸的核苷酸序列；或其同源序列；其中所述亚序列编码具有乙酰木聚糖酯酶活性的多肽片段。在一个优选的方面，亚序列含有SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列或其同源序列的至少540个核苷酸，更优选至少570个核苷酸，并且最优选至少600个核苷酸。

等位变体(allelic variant)：术语“等位变体”在本文中表示占据相同染色体基因座的基因的任何两种或两种以上可选形式。等位变异通过突变天然地发生，并且可导致种群内的多态性。基因突变可以是沉默的(在编码的多肽中无变化)或可以编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位变体是由基因的等位变体编码的多肽。

分离的多核苷酸：如本文使用的术语“分离的多核苷酸”指从来源分离的多核苷酸。在一个优选的方面，如通过琼脂糖电泳测定的，所述多核苷酸为至少1％纯，优选至少5％纯，更优选至少10％纯，更优选至少20％纯，更优选至少40％纯，更优选至少60％纯，甚至更优选至少80％纯，并且最优选至少90％纯。

基本上纯的多核苷酸：如本文使用的术语“基本上纯的多核苷酸”指多核苷酸制备物，其不含其它外来的或不期望的核苷酸，并且处于适于在遗传工程蛋白质生产体系中使用的形式。因此，基本上纯的多核苷酸含有按重量计至多10％，优选至多8％，更优选至多6％，更优选至多5％，更优选至多4％，更优选至多3％，甚至更优选至多2％，最优选至多1％，并且甚至最优选至多0.5％的与其天然或重组结合的其它多核苷酸材料。然而，基本上纯的多核苷酸可以包括天然存在的5’和3’非翻译区，如启动子和终止子。优选基本上纯的多核苷酸是按重量计至少90％纯，优选至少92％纯，更优选至少94％纯，更优选至少95％纯，更优选至少96％纯，更优选至少97％纯，甚至更优选至少98％纯，最优选至少99％，并且甚至最优选至少99.5％纯的。本发明的多核苷酸优选为基本上纯的形式，即所述多核苷酸制备物基本上(essentially)不含与其天然或重组结合的其它多核苷酸材料。所述多核苷酸可以是基因组、cDNA、RNA、半合成、合成来源的，或它们的任何组合。

编码序列：当用于本文时术语“编码序列”的意思是直接指定其蛋白产物的氨基酸序列的核苷酸序列。编码序列的边界通常由开读框确定，所述开读框通常以ATG起始密码子或可供选择的起始密码子如GTG和TTG开始，并且以终止密码子如TAA、TAG和TGA结束。编码序列可以是DNA、cDNA、合成的或重组的核苷酸序列。

cDNA：术语“cDNA”在本文中定义为能够通过反转录从得自真核细胞的成熟的、已剪接的mRNA分子制备的DNA分子。cDNA缺少可能存在于相应基因组DNA中的内含子序列。起始的(initial)、初级的RNA转录物是mRNA的前体，其通过一系列的步骤加工然后作为成熟的已剪接的mRNA出现。这些步骤包括通过称为剪接的过程去除内含子序列。因而源自mRNA的cDNA没有任何内含子序列。

核酸构建体：如本文使用的术语“核酸构建体”指单链或双链的核酸分子，所述核酸分子分离自天然存在的基因，或将所述核酸分子以本来不存在于(not otherwise exist)自然界中的方式修饰以含有核酸的区段或所述核酸分子是合成的。当所述核酸构建体含有表达本发明的编码序列所需的调控序列时，术语核酸构建体与术语“表达盒”同义。

调控序列(control sequence)：术语“调控序列”在本文定义为包括对编码本发明多肽的多核苷酸表达是必需的所有组分。各个调控序列对于编码所述多肽的核苷酸序列可以是天然的或外源的，或各个调控序列对于彼此可以是天然的或外源的。这些调控序列包括但不限于前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列和转录终止子。最少的情况，调控序列包括启动子和转录和翻译的终止信号。调控序列可以和目的为引入特异性限制位点的接头一起提供，所述特异性限制位点促进调控序列与编码多肽的核苷酸序列编码区的连接。

可操作地连接：术语“可操作地连接”在本文表示这样的构型，其中将调控序列置于相对于多核苷酸序列的编码序列的适当位置，使得调控序列指导多肽编码序列的表达。

表达：术语“表达”包括涉及多肽产生的任何步骤，其包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。

表达载体：术语“表达载体”在本文定义为线性的或环状的DNA分子，其包含编码本发明多肽的多核苷酸，并且所述多核苷酸与提供用于其表达的额外核苷酸可操作地连接。

宿主细胞：如本文中所使用的术语“宿主细胞”包括任何细胞类型，所述细胞类型对于使用包含本发明多核苷酸的核酸构建体或表达载体的转化、转染、转导等是易感的(susceptible)。

修饰：术语“修饰”在本文的意思是，对包含SEQ ID NO：2的成熟多肽或其同源序列的多肽或者由SEQ ID NO：2的成熟多肽或其同源序列组成的多肽的任何化学修饰，以及对编码这样的多肽的DNA的遗传操作。所述修饰可以是一个或多个(数个)氨基酸的取代、缺失和/或插入，以及一个或多个(数个)氨基酸侧链的置换。

人工变体：当用在本文时，术语“人工变体”的意思是具有乙酰木聚糖酯酶活性的多肽，所述多肽由表达SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列的修饰的多核苷酸序列或其同源序列的生物体产生。所述修饰的核苷酸序列通过人为干预(human intervention)，通过修饰公开于SEQ ID NO：1的多核苷酸序列或其同源序列来获得。

发明详述

具有乙酰木聚糖酯酶活性的多肽

在第一个方面，本发明涉及包含下述氨基酸序列的分离的多肽，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：2的成熟多肽具有优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，甚至更优选至少90％，最优选至少95％，并且甚至最优选至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性程度，所述多肽具有乙酰木聚糖酯酶活性(下文中的“同源多肽”)。在一个优选的方面，所述同源多肽包含的氨基酸序列与SEQ ID NO：2的成熟多肽相差十个氨基酸，优选相差五个氨基酸，更优选相差四个氨基酸，甚至更优选相差三个氨基酸，最优选相差两个氨基酸，并且甚至最优选相差一个氨基酸。

本发明的多肽优选包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列或其等位变体；或它们的具有乙酰木聚糖酯酶活性的片段。在一个优选的方面，多肽包含SEQID NO：2的氨基酸序列。在另一优选的方面，多肽包含SEQ ID NO：2的成熟多肽。在另一优选的方面，多肽包含SEQ ID NO：2的氨基酸18至228，或其等位变体；或它们的具有乙酰木聚糖酯酶活性的片段。在另一优选的方面，多肽包含SEQ ID NO：2的氨基酸18至228。在另一优选的方面，多肽由SEQ ID NO：2的氨基酸序列或其等位变体，或它们的具有乙酰木聚糖酯酶活性的片段组成。在另一优选的方面，多肽由SEQ ID NO：2的氨基酸序列组成。在另一优选的方面，多肽由SEQ ID NO：2的成熟多肽组成。在另一优选的方面，多肽由SEQ ID NO：2的氨基酸18至228或其等位变体，或它们的具有乙酰木聚糖酯酶活性的片段组成。在另一优选的方面，多肽由SEQ ID NO：2的氨基酸18至228组成。

在第二个方面，本发明涉及具有乙酰木聚糖酯酶活性的分离的多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在优选极低严格条件、更优选低严格条件、更优选中严格条件、更优选中-高严格条件、甚至更优选高严格条件、和最优选非常高严格条件下与下述杂交：(i)SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列；(ii)包含于SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列中的cDNA序列；或(iii)(i)或(ii)的全长互补链(J.Sambrook，E.F.Fritsch和T.Maniatis，1989，MolecularCloning，A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor，New York)。

SEQ ID NO：1的核苷酸序列或其亚序列；以及SEQ ID NO：2的氨基酸序列或其片段，可用于设计核酸探针，以根据本领域内公知的方法从不同属或种的菌株鉴定和克隆编码具有乙酰木聚糖酯酶活性的多肽的DNA。具体而言，可将这些探针用于根据标准的Southern印迹方法与感兴趣的属或种的基因组或cDNA杂交，以鉴定并从其中分离相应的基因。这些探针可明显短于完整序列，但长度上应为至少14个，优选至少25个，更优选至少35个，并且最优选至少70个核苷酸。然而，优选所述核酸探针长度上是至少100个核苷酸。例如，所述核酸探针长度上可以是至少200个核苷酸，优选至少300个核苷酸，更优选至少400个核苷酸，或最优选至少500个核苷酸。甚至可以使用更长的探针，例如，长度是优选至少600个核苷酸，更优选至少700个核苷酸，或最优选至少800个核苷酸的核酸探针。DNA和RNA探针二者均可使用。通常将探针标记以探测相应的基因(例如，用³²P、³H、³⁵S、生物素或抗生物素蛋白(avidin)标记)。将这些探针包含于本发明中。

因而，可从由这些其它菌株制备的基因组DNA或cDNA文库中筛选DNA，所述DNA与上述探针杂交并且编码具有乙酰木聚糖酯酶活性的多肽。可以通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳，或通过其它分离技术分离来自这些其它菌株的基因组或其它DNA。可以将来自文库的DNA或分离的DNA转移至硝化纤维素(nitrocellulose)或其它合适的载体材料并且固定于其上。为了鉴定与SEQ ID NO：1或其亚序列同源的克隆或DNA，将所述载体材料优选用在Sounthern印迹中。

就本发明而言，杂交表示核苷酸序列在非常低至非常高的严格条件下与标记的核酸探针杂交，所述核酸探针对应于SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列或其全长互补链；或其亚序列。可使用例如X射线片(X-ray film)检测在这些条件下与核酸探针杂交的分子。

在一个优选的方面，核酸探针是SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列。在另一优选的方面，核酸探针是SEQ ID NO：1的核苷酸52-885。在另一优选的方面，核酸探针是编码SEQ ID NO：2的多肽的多核苷酸序列，或其亚序列。在另一优选的方面，核酸探针是SEQ ID NO：1。在另一优选的方面，核酸探针是包含在大肠杆菌(E.coli)NRRL B-50156中的质粒pThihe117AXE1中含有的多核苷酸序列，其中所述其多核苷酸序列编码具有乙酰木聚糖酯酶活性的多肽。在另一优选的方面，核酸探针是包含在大肠杆菌NRRL B-50156中的质粒pThihe117AXE1中含有的成熟多肽编码区。

对于长度至少100个核苷酸的长探针，将非常低至非常高的严格条件定义为在42℃，在5X SSPE、0.3％SDS、200μg/ml已剪切并且变性的鲑精DNA中，并且对于非常低和低严紧性为25％的甲酰胺、对于中和中-高严紧性为35％的甲酰胺、或对于高和非常高严紧性为50％的甲酰胺，根据标准的Southern印迹步骤进行预杂交和杂交最佳12至24小时。

对于长度为至少100个核苷酸的长探针，使用2X SSC、0.2％SDS优选在45℃(非常低严紧性)，更优选在50℃(低严紧性)，更优选在55℃(中严紧性)，更优选在60℃(中-高严紧性)，甚至更优选在65℃(高严紧性)，并且最优选在70℃(非常高严紧性)将载体材料最终洗涤三次，每次15分钟。

对于长度大约15个核苷酸至大约70个核苷酸的短探针，将严格条件定义为在比使用根据Bolton和McCarthy计算法(1962，Proceedings of the NationalAcademy of Sciences USA 48：1390)计算出的T_m低大约5℃至大约10℃，在0.9MNaCl，0.09M Tris-HCl pH 7.6，6mM EDTA，0.5％NP-40，1X Denhardt溶液，1mM焦磷酸钠(sodium pyrophosphate)，1mM磷酸二氢钠(sodium monobasicphosphate)，0.1mMATP和0.2mg每ml的酵母RNA中，根据标准的Southern印迹步骤进行预杂交、杂交和杂交后洗涤最佳12至24小时。

对于长度大约15个核苷酸至大约70个核苷酸的短探针，将所述载体材料在6X SSC加0.1％SDS中洗涤一次15分钟，并使用6X SSC在比计算出的T_m低5℃至10℃的温度洗涤两次，每次15分钟。

在第三个方面，本发明涉及由如下多核苷酸编码的具有乙酰木聚糖酯酶活性的分离的多肽，所述多核苷酸包含与SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列具有优选至少75％、更优选至少80％、更优选至少85％、甚至更优选至少90％、最优选至少95％、并且甚至最优选至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％同一性程度的核苷酸序列或由所述核苷酸序列组成，其编码具有乙酰木聚糖酯酶活性的多肽。参见本文多核苷酸部分。

在第四个方面，本发明涉及人工变体，所述人工变体包含取代、缺失和/或插入一个或多个(或数个)氨基酸的SEQ ID NO：2的成熟多肽；或其同源序列。优选地，氨基酸改变对性质是较不重要的(of a minor nature)，即保守的氨基酸取代或插入，其不显著影响蛋白质的折叠和/或活性；通常为1至大约30个氨基酸的小缺失；小的氨基或羧基末端延伸，如氨基末端甲硫氨酸残基；多至大约20-25个残基的小接头肽；或通过改变净电荷或其它功能来促进纯化的小延伸，如多组氨酸序列(poly-histidine tract)、抗原表位(antigenic epitope)或结合域(binding domain)。

保守取代的实例是在以下组之内：碱性氨基酸组(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸组(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸组(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸组(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、芳族氨基酸组(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸组(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸)。通常不改变比活性(specific activity)的氨基酸取代是本领域已知的，并且由例如H.Neurath和R.L.Hill，1979，于The Proteins，Academic Press，New York中描述。最普遍发生的交换是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly。

除了20个标准氨基酸，非标准氨基酸(如4-羟脯氨酸、6-N-甲基赖氨酸、2-氨基异丁酸、异缬氨酸和α-甲基丝氨酸)可以取代野生型多肽的氨基酸残基。有限数量的非保守氨基酸、不由遗传密码编码的氨基酸和非天然氨基酸可以取代氨基酸残基。“非天然氨基酸”在蛋白质合成后已经过修饰，和/或在它们的侧链具有不同于基本氨基酸的化学结构。非天然氨基酸能够以化学方法合成，并且优选是商业上可得到的，包括六氢吡啶羧酸(pipecolic acid)、噻唑烷羧酸(thiazolidine carboxylic acid)、脱氢脯氨酸、3-和4-甲基脯氨酸，和3，3-二甲基脯氨酸。

可供选择的是，氨基酸改变具有这样的性质以使多肽的物理化学性质改变。例如，氨基酸改变可改进多肽的热稳定性，改变底物特异性，改变最适pH等。

能够根据本领域已知的方法，例如定位诱变或丙氨酸分区诱变法(Cunningham和Wells，1989，Science 244：1081-1085)来鉴定亲本多肽中的必需氨基酸。在后一技术中，将单一丙氨酸突变引入到分子中的每个残基，并且测试所得突变分子的生物活性(即，乙酰木聚糖酯酶活性)以鉴定对于所述分子的活性关键的氨基酸残基。同样参见Hilton等，1996，J.Biol.Chem.271：4699-4708。酶的活性部位或其它的生物相互作用也能够通过结构的物理分析而测定，如通过以下这些技术：如核磁共振、晶体学、电子衍射或光亲和标记，连同推定的接触位点氨基酸的突变来测定。参见例如de Vos等，1992，Science 255：306-312；Smith等，1992，J.Mol.Biol.224：899-904；Wlodaver等，1992，FEBSLett.309：59-64。必需氨基酸的身份(identity)也能够从与多肽的同一性分析来推断，所述多肽与根据本发明的多肽相关。

能够使用已知的诱变、重组和/或改组(shuffling)方法，然后是有关的筛选方法，例如那些由Reidhaar-Olson和Sauer，1988，Science 241：53-57；Bowie和Sauer，1989，Proc.Natl.Acad Sci.USA 86：2152-2156；WO 95/17413；或WO95/22625公开的那些方法来进行并测试单个或多个氨基酸取代、缺失、和/或插入。能够使用的其它方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如，Lowman等，1991，Biochem.30：10832-10837；美国专利5,223,409号；WO 92/06204)和区域定向的诱变(Derbyshire等，1986，Gene 46：145；Ner等，1988，DNA 7：127)。

诱变/改组方法能够与高通量、自动化的筛选方法组合以检测由宿主细胞表达的克隆的、诱变的多肽的活性(Ness等，1999，Nature Biotechnology 17：893-896)。能够从宿主细胞回收编码活性多肽的诱变的DNA分子，并且使用本领域内标准方法快速测序。这些方法允许快速测定感兴趣的多肽中单个氨基酸残基的重要性，并且能够应用于未知结构的多肽。

SEQ ID NO：2的成熟多肽的氨基酸取代、缺失和/或插入的总数是10，优选9，更优选8，更优选7，更优选至多6，更优选5，更优选4，甚至更优选3，最优选2，并且甚至最优选1。

具有乙酰木聚糖酯酶活性的多肽的来源

本发明具有乙酰木聚糖酯酶活性的多肽可以获得自任何属的微生物。就本发明而言，用于本文与给定的来源有关的术语“获得自”，意思是核苷酸序列编码的多肽由所述来源产生，或由其中插入了来自所述来源的核苷酸序列的菌株产生。在一个优选的方面，获得自给定来源的多肽是胞外分泌的。

本发明具有乙酰木聚糖酯酶活性的多肽可以是细菌多肽。例如，所述多肽可以是革兰氏阳性细菌多肽如芽孢杆菌属(Bacillus)、链球菌属(Streptococcus)、链霉菌属(Streptomyces)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、肠球菌属(Ehterococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、梭菌属(Clostridium)、地芽孢杆菌属(Geobacillus)或海洋芽孢杆菌属(Oceanobacillus)多肽，所述多肽具有乙酰木聚糖酯酶活性；或革兰氏阴性细菌多肽，如大肠杆菌、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙门氏菌属(Salmonella)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、螺杆菌属(Helicobacter)、黄杆菌属(Flavobacterium)、梭杆菌属(Fusobacterium)、泥杆菌属(Ilyobacter)、奈瑟氏菌属(Neisseria)或脲原体属(Ureaplasma)多肽，所述多肽具有乙酰木聚糖酯酶活性。

在一个优选的方面，所述多肽是具有乙酰木聚糖酯酶活性的嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、坚强芽孢杆菌(Bacillusfirmus)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)多肽。

在另一个优选的方面，所述多肽是具有乙酰木聚糖酯酶活性的似马链球菌(Streptococcus equisimilis)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、乳房链球菌(Streptococcus uberis)或马链球菌兽瘟亚种(Streptococcus equi subsp.Zooepidem icus)多肽。

在另一个优选的方面，所述多肽是具有乙酰木聚糖酯酶活性的不产色链霉菌(Streptomyces achromogenes)、除虫链霉菌(Streptomyces avermitilis)、天蓝链霉菌(Streptomyces coelicolor)、灰色链霉菌(Streptomyces griseus)或浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)多肽。

本发明具有乙酰木聚糖酯酶活性的多肽也可以是真菌多肽，并且更优选酵母多肽如假丝酵母属(Candida)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)或西洋蓍霉属(Yarrowia)多肽，其具有乙酰木聚糖酯酶活性；或更优选丝状真菌多肽如枝顶孢霉属(Acremonium)、伞菌属(Agaricus)、链格孢属(Alternaria)、曲霉属(Aspergillus)、短梗霉属(Aurureobasidium)、Botryospaeria、拟蜡菌属(Ceriporiopsis)、毛喙壳属(Chaetomidium)、金孢子菌属(Chrysosporium)、Claviceps、Cochliobolus、鬼伞属(Coprinopsis)、Coptotermes、棒囊壳属(Corynascus)、隐丛赤壳菌属(Cryphonectria)、隐球菌属(Cryptococcus)、色二孢属(Diplodia)、黑耳属(Exidia)、Filibasidium、镰孢属(Fusarium)、赤霉属(Gibberella)、全鞭毛虫属(Holomastigotoides)、腐质霉属(Humicola)、耙齿菌属(Irpex)、蘑菇属(Lentinula)、Leptospaeria、梨孢菌属(Magnaporthe)、Melanocarpus、多孔菌属(Meripilus)、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、新考玛脂霉属(Neocallimastix)、脉孢菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、平革菌属(Phanerochaete)、瘤胃壶菌属(Piromyces)、Poitrasia、假黑盘菌属(Pseudoplectania)、Pseudotrichonympha、根毛霉属(Rhizomucor)、裂褶菌属(Schizophyllum)、柱顶孢属(Scytalidium)、踝节菌属(Talaromyces)、嗜热子囊菌属/嗜热霉属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)、木霉属(Trichoderma)、长毛盘菌属(Trichophaea)、轮枝孢属(Verticillium)、包脚菇属(Volvariella)或炭角菌属(Xylaria)多肽，其具有乙酰木聚糖酯酶活性。

在一个优选的方面，所述多肽是具有乙酰木聚糖酯酶活性的卡尔酵母(Saccharomyces carlsbergensis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)、道格拉氏酵母(Saccharomyces douglasii)、克鲁弗酵母(Saccharomyces kluyveri)、诺地酵母(Saccharomyces norbensis)或卵形酵母(Saccharomyces oviformis)多肽。

在另一优选的方面，所述多肽是具有乙酰木聚糖酯酶活性的解纤维枝顶孢霉(Acremonium cellulolyticus)、棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、臭曲霉(Aspergillusfoetidus)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、嗜角质金孢子菌(Chrysosporium keratinophilum)、Chrysosporium lucknowense、热带金孢子菌(Chrysosporium tropicum)、Chrysosporium merdarium、Chrysosporium inops、毡金孢子菌(Chrysosporium pannicola)、Chrysosporium queenslandicum、Chrysosporium zonatum、杆孢状镰孢(Fusarium bactridioides)、禾谷镰孢(Fusarium cerealis)、库威镰孢(Fusarium crookwellense)、大刀镰孢(Fusariumculmorum)、禾本科镰孢(Fusarium graminearum)、禾赤镰孢(Fusariumgraminum)、异孢镰孢(Fusarium heterosporum)、合欢木镰孢(Fusariumnegundi)、尖镰孢(Fusarium oxysporum)、多枝镰孢(Fusarium reticulatum)、粉红镰孢(Fusarium roseum)、接骨木镰孢(Fusarium sambucinum)、肤色镰孢(Fusarium sarcochroum)、拟分枝孢镰孢(Fusarium sporotrichioides)、硫色镰孢(Fusarium sulphureum)、圆镰孢(Fusarium torulosum)、拟丝孢镰孢(Fusariumtrichothecioides)、镶片镰孢(Fusarium venenatum)、灰腐质霉(Humicola grisea)、特异腐质霉(Humicola insolens)、疏棉状腐质霉(Humicola lanuginose)、Irpexlacteus、米黑毛霉(Mucor miehei)、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)、绳状青霉(Penicillium funiculosum)、产紫青霉(Penicillium purpurogenum)、黄孢平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、Thielavia achromatica、Thielavia albomyces、Thielavia albopilosa、Thielaviaaustraleinsis、Thielavia fimeti、Thielavia microspora、Thielavia ovispora、Thielavia peruviana、瘤孢梭孢壳(Thielavia spededonium)、毛梭孢壳(Thielaviasetosa)、Thielavia subthermophila、土生梭孢霉(Thielavia terrestris)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、康宁木霉(Trichoderma koningii)、长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)、里氏木霉(Trichoderma reesei)或绿色木霉(Trichoderma viride)多肽。

在一个最优选的方面，所述多肽是具有乙酰木聚糖酯酶活性的嗜热毁丝霉多肽。在一个最优选的方面，所述多肽是具有乙酰木聚糖酯酶活性的嗜热毁丝霉CBS 117.65多肽，例如，包含SEQ ID NO：2的成熟多肽的多肽。

可理解的是对于前述的种，本发明包含完全和不完全阶段(perfect andimperfect states)，和其它分类学的等同物(equivalent)，例如无性型(anamorph)，而无论它们已知的种名。本领域的技术人员会容易地识别适合的等同物的身份(identity)。

这些种的菌株在许多培养物保藏机构对于公众能够容易地取得，所述保藏机构如美国典型培养物保藏中心(the American Type Culture Collection)(ATCC)、德意志微生物和细胞培养物保藏中心(Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH)(DSM)、真菌菌种保藏中心(Centraalbureau Voor Schimmelcultures)(CBS)和农业研究机构专利培养物保藏中心北区研究中心(Agricultural Research Service Patent Culture Collection，Northern Regional Research Center)(NRRL)。

此外，可以使用上述的探针从其它来源，包括从自然界(例如，土壤、堆肥、水等)分离的微生物鉴定和获得这些多肽。用于从天然生境(habitat)分离微生物的技术是本领域内公知的。随后可通过相似地筛选这种微生物的基因组或cDNA文库来获得所述多核苷酸。一旦用所述探针检测到编码多肽的多核苷酸，就能够使用本领域普通技术人员熟知的技术将所述多核苷酸分离或克隆(参见，例如，Sambrook等，1989，见上)。

本发明的多肽还包括融合多肽或可切割的融合多肽，其中将另外的多肽融合到所述多肽或其片段的N末端或C末端。通过将编码另一个多肽的核苷酸序列(或其部分)融合于本发明的核苷酸序列(或其部分)来产生融合的多肽。产生融合多肽的技术是本领域已知的，并包括连接编码多肽的编码序列以使它们在阅读框中，并且使所述融合多肽的表达在相同启动子和终止子的控制下。

融合多肽还可以包括切割位点。一旦分泌了融合多肽，就切割所述位点，从融合蛋白释放具有乙酰木聚糖酯酶活性的多肽。切割位点的实例包括，但不限于，编码二肽Lys-Arg的Kex2位点(Martin等，2003，J.Ind Microbiol.Biotechnol.3：568-576；Svetina等，2000，J.Biotechnol.76：245-251；Rasmussen-Wilson等，1997，Appl.Environ.Microbiol.63：3488-3493；Ward等，1995，Biotechnology 13：498-503；和Contreras等，1991，Biotechnology 9：378-381)；Ile-(Glu或Asp)-Gly-Arg位点，其在精氨酸残基后通过因子Xa蛋白酶切割(Eaton等，1986，Biochem.25：505-512)；Asp-Asp-Asp-Asp-Lys位点，其在赖氨酸后通过肠激酶切割(Collins-Racie等，1995，Biotechnology 13：982-987)；His-Tyr-Glu位点或His-Tyr-Asp位点，其通过Genenase I切割(Carter等，1989，Proteins：Structure，Function，and Genetics 6：240-248)；Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser位点，其在Arg后通过凝血酶切割(Stevens，2003，Drug Discovery World 4：35-48)；Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Gly位点，其在Gln后通过TEV蛋白酶切割(Stevens，2003，见上)；和Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln-Gly-Pro位点，其在Gln后通过遗传工程形式的人鼻病毒3C蛋白酶切割(Stevens，2003，见上)。

多核苷酸

本发明还涉及分离的多核苷酸，其包含编码本发明具有乙酰木聚糖酯酶活性的多肽的核苷酸序列，或由该核苷酸序列组成。

在一个优选的方面，核苷酸序列包含SEQ ID NO：1或由SEQ ID NO：1组成。在另一更优选的方面，核苷酸序列包含大肠杆菌NRRL B-50156中所含质粒pThihe117AXE1中含有的序列，或由该序列组成。在另一优选的方面，核苷酸序列包含SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列或由SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列组成。在另一优选的方面，核苷酸序列包含SEQ ID NO：1的核苷酸52-885或由SEQ ID NO：1的核苷酸52-885组成。在另一更优选的方面，核苷酸序列包含大肠杆菌NRRL B-50156中所含质粒pThihe117AXE1中含有的成熟多肽编码序列或由该成熟多肽编码序列组成。本发明还包含编码如下多肽的核苷酸序列，所述多肽包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列或其成熟多肽，或由SEQ ID NO：2的氨基酸序列或其成熟多肽组成；由于遗传密码的简并性，所述核苷酸序列不同于SEQ ID NO：1或其成熟多肽编码序列。本发明还涉及SEQ ID NO：1的亚序列，所述亚序列编码具有乙酰木聚糖酯酶活性的SEQ ID NO：2的片段。

本发明还涉及突变的多核苷酸，其在SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列中包含至少一个突变或由具有至少一个突变的SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列组成，其中突变的核苷酸序列编码SEQ ID NO：2的成熟多肽。

用于分离或克隆编码多肽的多核苷酸的技术是本领域内已知的，且包括从基因组DNA分离，从cDNA制备，或其组合。可通过例如使用熟知的聚合酶链式反应(PCR)或表达文库的抗体筛选来检测具有共有结构特性的克隆DNA片段，从而实现从这种基因组DNA克隆本发明的多核苷酸。参见，例如，Innis等，1990，PCR：A Guide to Methods and Application，Academic Press，New York。可以使用其它核酸扩增方法，如连接酶链式反应(LCR)、连接活化转录(ligatedactivated transcription；LAT)和基于核苷酸序列的扩增(NASBA)。可以从腐质霉属菌株，或另外的或相关的生物体克隆所述多核苷酸，并且因此可以是例如所述核苷酸序列的多肽编码区的等位基因变体或种变体(species variant)。

本发明还涉及分离的多核苷酸，其包含下述核苷酸序列或由其组成，所述核苷酸序列与SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列具有优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，甚至更优选至少90％，最优选至少95％，并且甚至最优选至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性程度，所述多核苷酸编码具有乙酰木聚糖酯酶活性的多肽。

修饰编码本发明多肽的核苷酸序列对于合成与所述多肽基本上相似的多肽可为必需的。术语与所述多肽“基本上相似”指多肽的非天然存在的形式。这些多肽可能以一些工程改造的方式而不同于从其天然来源分离的多肽，例如，比活性、热稳定性、最适pH等方面不同的人工变体。可以在作为SEQ IDNO：1的成熟多肽编码序列存在的核苷酸序列，例如其亚序列的基础上，和/或通过引入如下核苷酸取代来构建变体序列：所述取代不产生由核苷酸序列编码的多肽的另外的氨基酸序列，但是符合意欲产生酶的宿主生物体的密码子选择；或者所述取代可产生不同的氨基酸序列。关于核苷酸取代的概述，参见，例如，Ford等，1991，Protein Expression and Purificatton 2：95-107。

对于本领域技术人员显而易见的是，这些取代能够在对于分子功能重要的区域之外进行，并且仍然产生活性多肽。对于由本发明的分离的多核苷酸编码的多肽活性关键的并且因此优选不进行取代的氨基酸残基，可以根据本领域公知的方法，如定位诱变或丙氨酸分区诱变法(参见，例如，Cunningham和Wells，1989，见上)来鉴定。在后一技术中，将突变引入到分子中的每个荷正电的残基处，并且测试所得突变分子的乙酰木聚糖酯酶活性，以鉴定对于所述分子的活性关键的氨基酸残基。底物-酶相互作用的位点也能够通过分析三维结构测定，通过如核磁共振分析、晶体学或光亲和标记这样的技术来测定(参见，例如，de Vos等，1992，见上；Smith等，1992，见上；Wlodaver等，1992，见上)。

本发明还涉及编码本发明多肽的分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸在非常低严格条件下，优选低严格条件，更优选中严格条件，更优选中-高严格条件，甚至更优选高严格条件，并且最优选非常高的严格条件下与下述杂交：(i)SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列；(ii)包含于SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列中的cDNA序列；或(iii)(i)或(ii)的全长互补链，或它们的等位变体和亚序列(Sambrook等，1989，同上)，如本文所定义的。

本发明还涉及通过如下获得的分离的多核苷酸：(a)在非常低、低、中、中-高、高或非常高严格条件下，将DNA的群体与下述杂交：(i)SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列；(ii)包含于SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列中的cDNA序列；或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；和(b)分离杂交的多核苷酸，其编码具有乙酰木聚糖酯酶活性的多肽。

核酸构建体

本发明还涉及包含本发明的分离的多核苷酸的核酸构建体，所述分离的多核苷酸与一个或多个(数个)调控序列可操作地连接，所述调控序列在合适的宿主细胞中在与该调控序列相容的条件下指导编码序列的表达。

可以用许多方式操作编码本发明多肽的分离的多核苷酸以供多肽的表达。依赖于表达载体，在将多核苷酸的序列插入载体之前对其进行操作可能是理想的或必需的。使用重组DNA方法修饰多核苷酸序列的技术是本领域熟知的。

调控序列可以是适当的启动子序列，其是由用于表达编码本发明多肽的多核苷酸的宿主细胞识别的核苷酸序列。启动子序列含有介导多肽的表达的转录调控序列。启动子可以是在所选的宿主细胞中显示转录活性的任何核苷酸序列，包括突变的、截短的和杂合的启动子，并且可以从编码与宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因获得。

用于指导本发明的核酸构建体转录，特别是在细菌宿主细胞中转录的合适启动子的实例是从下述获得的启动子：大肠杆菌lac操纵子、天蓝链霉菌琼脂糖酶基因(dagA)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、嗜热脂肪芽孢杆菌产麦芽淀粉酶基因(amyM)、解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因和原核β-内酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等，1978，Proceedings of theNational Academy of Sciences USA 75：3727-3731)，以及tac启动子(DeBoer等，1983，Proceedings of the National Academy of Sciences USA 80：21-25)。另外的启动子在″Useful proteins from recombinant bacteria″于Scientific American，1980，242：74-94中；和在Sambrook等，1989，见上中描述。

用于指导本发明的核酸构建体在丝状真菌宿主细胞中转录的合适启动子的实例是从下列酶的基因获得的启动子：米曲霉TAKA淀粉酶、曼赫根毛霉(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、曼赫根毛霉脂肪酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、构巢曲霉乙酰胺酶、镶片镰孢淀粉葡糖苷酶(WO 00/56900)、镶片镰孢Daria(WO 00/56900)、镶片镰孢Quinn(WO 00/56900)、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶(WO 96/00787)、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶IV、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉β-木糖苷酶，以及NA2-tpi启动子(来自黑曲霉中性α-淀粉酶基因和米曲霉丙糖磷酸异构酶基因的启动子的杂合体)；和它们的突变的、截短的和杂合的启动子。

在酵母宿主中，有用的启动子从如下酶的基因获得：酿酒酵母烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH1，ADH2/GAP)、酿酒酵母丙糖磷酸异构酶(TPI)、酿酒酵母金属硫蛋白(CUP1)和酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。对于酵母宿主细胞有用的其它启动子由Romanos等，1992，Yeast 8：423-488描述。

调控序列也可以是合适的转录终止子序列，其是由宿主细胞识别以终止转录的序列。所述终止子序列与编码所述多肽的核苷酸序列的3’末端可操作地连接。可以将在所选宿主细胞中有功能的任何终止子用在本发明中。

对于丝状真菌宿主细胞优选的终止子从如下酶的基因获得：米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉α-葡糖苷酶和尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶。

对于酵母宿主细胞优选的终止子从如下酶的基因获得：酿酒酵母烯醇化酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)和酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶。对于酵母宿主细胞有用的其它终止子由Romanos等，1992，见上描述。

调控序列还可以是合适的前导序列，其是对于宿主细胞的翻译重要的mRNA非翻译区。前导序列可操作地连接于编码多肽的核苷酸序列的5’-末端。可以将在所选宿主细胞中有功能的任何前导序列用在本发明中。

对于丝状真菌宿主细胞优选的前导序列从如下酶的基因获得：米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶。

对于酵母宿主细胞合适的前导序列从如下酶的基因获得：酿酒酵母烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α因子和酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)。

调控序列也可以是聚腺苷酸化序列，其是与核苷酸序列的3’末端可操作地连接的序列，并且在转录时，宿主细胞将其识别为向转录的mRNA添加聚腺苷残基的信号。可以将在所选宿主细胞中有功能的任何聚腺苷酸化序列在本发明中使用。

对于丝状真菌宿主细胞优选的聚腺苷酸化序列从如下酶的基因获得：米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶和黑曲霉α-葡糖苷酶。

对于酵母宿主细胞有用的聚腺苷酸化序列由Guo和Sherman，1995，Molecular Cellular Biology 15：5983-5990描述。

调控序列还可以是信号肽编码序列，其编码与多肽的氨基末端相连的信号肽，并且指导编码的多肽进入细胞分泌途径。核苷酸序列的编码序列5’端可固有地包含信号肽编码序列，该信号肽编码序列与编码分泌多肽的编码序列区段一起天然地连接在翻译阅读框中。或者，编码序列5’端可含有对于所述编码序列为外源的信号肽编码序列。外源信号肽编码序列在编码序列不天然地含有信号肽编码序列时可为必需的。或者，外源信号肽编码序列可以简单地取代天然信号肽编码序列以增强多肽的分泌。然而，指导表达的多肽进入所选宿主细胞的分泌途径(即，分泌至培养基中)的任何信号肽编码序列可在本发明中使用。

对于细菌宿主细胞有效的信号肽编码序列是从如下酶的基因获得的信号肽编码序列：芽孢杆菌属NCIB 11837产麦芽糖淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草蛋白酶(subtilisin)、地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT，nprS，nprM)和枯草芽孢杆菌prsA。另外的信号肽由Simonen和Palva，1993，Microbiological Reviews 57：109-137描述。

对于丝状真菌宿主细胞有效的信号肽编码序列是从如下酶的基因获得的信号肽编码序列：米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、特异腐质霉纤维素酶、特异腐质霉内切葡聚糖酶V和疏棉状腐质霉脂肪酶。

对于酵母宿主细胞有用的信号肽从酿酒酵母α因子和酿酒酵母转化酶的基因获得。其它有用的信号肽编码序列由Romanos等，1992，见上描述。

在一个优选的方面，信号肽包含SEQ ID NO：2的氨基酸1至17或由SEQID NO：2的氨基酸1至17组成。在另一优选的方面，信号肽编码序列包含SEQ ID NO：1的核苷酸1至51或由SEQ ID NO：1的核苷酸1至51组成。

调控序列还可以是前肽编码序列，其编码位于多肽氨基末端的前肽。所得多肽称为酶原(proenzyme)或前多肽(propolypeptide)(或在某些情况下称为酶原(zymogen))。前(多)肽通常是无活性的并且能够通过从前多肽催化或自催化切割所述前肽而转化为成熟活性多肽。前肽编码序列可从如下酶的基因获得：枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、酿酒酵母α因子、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶和嗜热毁丝霉漆酶(WO 95/33836)。

当信号肽和前肽序列二者均出现在多肽的氨基末端时，使前肽序列的位置紧接着(next to)多肽氨基末端，并且使信号肽序列的位置紧接着前肽序列的氨基末端。

同样理想的是添加调节序列，其允许相对于宿主细胞的生长来调节多肽的表达。调节系统的实例是引起基因表达响应化学或物理刺激物，包括调节化合物的存在而开启或关闭的那些系统。原核系统中的调节系统包括lac、tac和trp操纵基因系统。在酵母中，可以使用ADH2系统或GAL1系统。在丝状真菌中，可以使用TAKA α-淀粉酶启动子、黑曲霉葡糖淀粉酶启动子和米曲霉葡糖淀粉酶启动子作为调节序列。调节序列的其它实例是那些允许基因扩增的序列。在真核系统中，这些调节序列包括在氨甲蝶呤(methotrexate)存在下扩增的二氢叶酸还原酶基因，和以重金属(with heavy metal)扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况下，编码多肽的核苷酸序列与调节序列可操作地连接。

表达载体

本发明还涉及重组表达载体，所述重组表达载体包含本发明的多核苷酸、启动子和转录和翻译终止信号。本文所述的多种核酸和调控序列可以结合在一起以产生重组表达载体，所述表达载体可以包括一个或多个(数个)方便的限制位点以允许在这些位点插入或取代编码多肽的核苷酸序列。可供选择的是，可以通过在适当的用于表达的载体中插入包含所述序列的核苷酸序列或核酸构建体来表达本发明的多核苷酸序列。在制备表达载体的过程中，将编码序列置于载体中，从而将该编码序列与适当的表达用调控序列可操作地连接。

重组表达载体可以是任何载体(例如，质粒或病毒)，其能够方便地进行重组DNA步骤，并且能够产生核苷酸序列的表达。载体的选择将通常依赖于载体与将引入该载体的宿主细胞的相容性。载体可以是线状或闭合环状质粒。

载体可以是自主复制载体，即，作为染色体外实体(entity)存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如，质粒、染色体外元件、微型染色体(minichromosome)或人工染色体。载体可以含有任何用于确保自复制的手段(means)。或者，载体可以是一种当被引入宿主细胞中时，整合到基因组中并且与整合了该载体的染色体一起复制的载体。此外，可以使用单独的载体或质粒或两个或更多个载体或质粒，其共同含有待引入宿主细胞基因组的完整DNA(total DNA)，或可以使用转座子(transposon)。

本发明的载体优选地含有一个或多个(数个)选择性标记，其允许简单选择经转化、转染、转导等的细胞。选择性标记是基因，其产物提供杀生物剂或病毒抗性、对重金属的抗性、对营养缺陷型的原养性(prototrophy to auxotrophs)等。

细菌选择性标记的实例是来自枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的dal基因，或赋予抗生素抗性的标记，所述抗生素抗性如氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素或四环素抗性。对于酵母宿主细胞合适的标记是ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。用于丝状真菌宿主细胞的选择性标记包括但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草铵膦(phosphinothricin)乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)(nitrate reductase)、pyrG(乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶)(orotidine-5’-phosphate decarboxylase)、sC(硫酸腺苷酰转移酶)和trpC(邻氨基苯甲酸合酶(anthranilate synthase))以及它们的等同物。优选用在曲霉属细胞中的是构巢曲霉或米曲霉的amdS和pyrG基因和吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的bar基因。

本发明的载体优选含有元件，其允许载体整合入宿主细胞基因组或允许载体在细胞中独立于基因组自主复制。

为了整合入宿主细胞基因组，载体可依赖编码多肽的多核苷酸的序列或用于通过同源或非同源重组整合入基因组的任何其它载体元件。或者，载体可以含有额外的核苷酸序列，用于指导通过同源重组整合入宿主细胞基因组染色体中的精确位置。为了增加在精确位置整合的可能性，整合元件应优选含有足够数量的核酸，如100至10,000碱基对，优选400至10,000碱基对，并且最优选800至10,000碱基对，其与相应的目标序列具有高度同一性以增强同源重组的概率。整合元件可以是任何序列，其与宿主细胞基因组中的目标序列同源。此外，整合元件可以是非编码或编码的核苷酸序列。另一方面，可以将载体通过非同源重组整合到宿主细胞的基因组中。

为了自主复制，载体可以还包含复制起点，其使载体能够在所述的宿主细胞中自主地复制。复制起点可以是介导自主复制的任何质粒复制子(replicator)，其在细胞中发挥功能。术语“复制起点”或“质粒复制子”在本文定义为能够使质粒或载体体内复制的核苷酸序列。

细菌复制起点的实例是允许在大肠杆菌中复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177和pACYC184的复制起点，和允许在芽孢杆菌属中复制的质粒pUB110、pE194、pTA1060和pAMβ1的复制起点。

用于酵母宿主细胞中的复制起点的实例是2微米复制起点，ARS1，ARS4，ARS1和CEN3的组合，和ARS4和CEN6的组合。

在丝状真菌细胞中有用的复制起点的实例是AMA1和ANS1(Gems等，1991，Gene 98：61-67；Cullen等，1987，NucleicAcidsResearch 15：9163-9175；WO 00/24883)。分离AMA1基因和构建包含该基因的质粒或载体能够根据WO 00/24883中公开的方法完成。

可以将多于一个拷贝的本发明的多核苷酸插入宿主细胞以增加基因产物的产生。多核苷酸拷贝数的增加可通过如下方法获得：将至少一个额外拷贝的序列整合入宿主细胞基因组，或将可扩增的选择性标记基因包括于多核苷酸，其中可通过在合适的选择剂(selectable agent)存在下培养细胞来选择含有选择性标记基因的扩增拷贝，从而也含有多核苷酸的额外拷贝的细胞。

用于连接上述元件以构建本发明的重组表达载体的方法是本领域技术人员熟知的(参见，例如，Sambrook等，1989，见上)。

宿主细胞

本发明还涉及重组宿主细胞，其包含本发明的分离的多核苷酸可操作地连接于一个或多个(几个)调控序列，其指导具有乙酰木聚糖酯酶活性的肽的产生。将包含本发明的多核苷酸的构建体或载体引入宿主细胞从而将所述载体作为染色体整合体或作为自复制的染色体外载体保持，如前文所述。术语“宿主细胞”包含亲本细胞的任何子代，其因为在复制过程中发生的突变而与该亲本细胞不同。宿主细胞的选择在很大程度上会依赖于编码多肽的基因及其来源。

宿主细胞可以是在本发明的多肽的重组产生中有用的任何细胞，例如，原核或真核细胞。

原核宿主细胞可以是任何革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌。革兰氏阳性细菌包括但不限于，芽孢杆菌属、链球菌属、链霉菌属、葡萄球菌属、肠球菌属、乳杆菌属、乳球菌属、梭菌属、地芽孢杆菌属和海洋芽孢杆菌属。革兰氏阴性细菌包括但不限于，大肠杆菌、假单胞菌属、沙门氏菌属、弯曲杆菌属、螺杆菌属、黄杆菌属、梭杆菌属、泥杆菌属、奈瑟氏菌属和脲原体属。

细菌宿主细胞可以是任何芽孢杆菌细胞。在本发明的实施中有用的芽孢杆菌属细胞包括但不限于，嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌细胞。

在一个优选的方面，细菌宿主细胞是解淀粉芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌细胞。在更优选的方面，细菌宿主细胞是解淀粉芽孢杆菌细胞。在另一个更优选的方面，细菌宿主细胞是克劳氏芽孢杆菌细胞。在另一个更优选的方面，细菌宿主细胞是地衣芽孢杆菌细胞。在另一个更优选的方面，细菌宿主细胞是枯草芽孢杆菌细胞。

细菌宿主细胞还可以是任何链球菌属细胞。在本发明的实施中有用的链球菌属细胞包括但不限于，似马链球菌、酿脓链球菌、乳房链球菌和马链球菌兽瘟亚种细胞。

在一个优选的方面，细菌宿主细胞是似马链球菌细胞。在另一个优选方面，细菌宿主细胞是酿脓链球菌细胞。在另一个优选的方面，细菌宿主细胞是乳房链球菌细胞。在另一个优选的方面，细菌宿主细胞是马链球菌兽瘟亚种细胞。

细菌宿主细胞还可以是任何链霉菌属细胞。在本发明的实施中有用的链霉菌属细胞包括但不限于，不产色链霉菌、除虫链霉菌、天蓝链霉菌、灰色链霉菌和浅青紫链霉菌细胞。

在一个优选的方面，细菌宿主细胞是不产色链霉菌细胞。在另一个优选的方面，细菌宿主细胞是除虫链霉菌细胞。在另一个优选的方面，细菌宿主细胞是天蓝链霉菌细胞。在另一个优选的方面，细菌宿主细胞是灰色链霉菌细胞。在另一个优选的方面，细菌宿主细胞是浅青紫链霉菌细胞。

可通过如下方法实现将DNA引入到芽孢杆菌属细胞：例如原生质体转化(参见，例如，Chang和Cohen，1979，Molecular General Genetics 168：111-115)，使用感受态细胞(参见，例如，Young和Spizizen，1961，Journal of Bacteriology 81：823-829或Dubnau和Davidoff-Abelson，1971，Journal of Molecular Biology 56：209-221)，电穿孔(参见，例如，Shigekawa和Dower，1988，Biotechniques 6：742-751)或接合(参见，例如，Koehler和Thorne，1987，Journal of Bacteriology 169：5271-5278)。可通过如下方法实现将DNA引入到大肠杆菌细胞：例如原生质体转化(参见，例如，Hanahan，1983，J.Mol.Biol.166：557-580)或电穿孔(参见，例如，Dower等，1988，Nucleic Acids Res.16：6127-6145)。可通过如下方法实现将DNA引入到链霉菌属细胞：例如原生质体转化和电穿孔(参见，例如，Gong等，2004，Folia Microbiol.(Praha)49：399-405)，接合(参见，例如，Mazodier等，1989，J.Bacteriol.171：3583-3585)，或转导(参见，例如，Burke等，2001，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98：6289-6294)。可通过如下方法实现将DNA引入到假单胞菌属细胞：例如电穿孔(参见，例如，Choi等，2006，J.Microbiol.Methods 64：391-397)或接合(参见，例如，Pinedo和Smets，2005，Appl.Environ.Microbiol.71：51-57)。可通过如下方法实现将DNA引入到链球菌属细胞：例如天然感受态(naturalcompetence)(参见，例如，Perry和Kuramitsu，1981，Infect.Immun.32：1295-1297)，原生质体转化(参见，例如，Catt和Jollick，1991，Microbios.68：189-207)，电穿孔(参见，例如，Buckley等，1999，Appl.Environ.Microbiol.65：3800-3804)或接合(参见，例如，Clewell，1981，Microbiol.Rev.45：409-436)。然而，可以使用任何本领域已知的将DNA引入宿主细胞的方法。

宿主细胞还可以是真核生物，如哺乳动物、昆虫、植物或真菌细胞。

在一个优选的方面，宿主细胞是真菌细胞。“真菌”用在本文包括以下门：子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)和接合菌门(zygomycota)(如由Hawksworth等，于Ainsworth and Bisby’sDictionary of The Fungi，第八版，1995，CAB International，University Press，Cambridge，UK中所定义)以及卵菌门(Oomycota)(如Hawksworth等，1995，见上，171页中所引用)，和所有有丝分裂孢子真菌(mitosporic fungi)(Hawksworth等，1995，见上)。

在更优选的方面，真菌宿主细胞是酵母细胞。“酵母”用在本文包括产子囊酵母(ascosporogenous yeast)(内孢霉目(Endomycetales))、产担子酵母(basidiosporogenous yeast)和属于半知菌类(Fungi Imperfecti)(芽孢纲(Blastomycetes))的酵母。由于酵母的分类在未来可能改变，就本发明而言，会将酵母定义为如Biology and Activities of Yeast(Skinner，F.A.，Passmore，S.M.，和Davenport，R.R.编，Soc.App.Bacteriol.Symposium Series No.9，1980)中所述。

在甚至更加优选的方面，酵母宿主细胞是假丝酵母属、汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母属、毕赤酵母属、酵母属、裂殖酵母属或西洋蓍霉属细胞。

在一个最优选的方面，酵母宿主细胞是卡尔酵母、酿酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母、克鲁弗酵母、诺地酵母或卵形酵母细胞。在另一个最优选的方面，酵母宿主细胞是乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)细胞。在另一个最优选的方面，酵母宿主细胞是解脂西洋蓍霉(Yarrowia lipolytica)细胞。

在另一个更优选的方面，真菌宿主细胞是丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌门(Eumycota)和卵菌门的亚门(如由Hawksworth等，1995，见上文，所定义)的所有丝状形式。丝状真菌通常的特征在于由壳多糖(chitin)、纤维素、葡聚糖、壳聚糖(chitosan)、甘露聚糖和其它复杂多糖组成的菌丝体壁。通过菌丝延伸进行营养生长，而碳分解代谢是专性需氧的。相反，酵母例如酿酒酵母的营养生长通过单细胞菌体的出芽生殖(budding)进行，而碳分解代谢可以是发酵的。

在一个甚至更优选的方面，丝状真菌宿主细胞是枝顶孢霉属、曲霉属、短梗霉属、烟管霉属(Bjerkandera)、Ceriporiopsis、金孢子菌属、鬼伞属(Coprinus)、革盖菌属(Coriolus)、隐球菌属、Filibasidium、镰孢属、腐质霉属、梨孢菌属、毛霉属、毁丝霉属、新考玛脂霉属、脉孢菌属、拟青霉属、青霉属、平革菌属、射脉菌属(Phlebia)、瘤胃壶菌属、侧耳属(Pleurotus)、裂褶菌属、踝节菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、栓菌属(Trametes)或木霉属细胞。

在一个最优选的方面，丝状真菌宿主细胞是泡盛曲霉、烟曲霉、臭曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉或米曲霉细胞。在另一个最优选的方面，丝状真菌宿主细胞是杆孢状镰孢、禾谷镰孢、库威镰孢、大刀镰孢、禾本科镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰孢、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰孢或镶片镰孢细胞。在另一个最优选的方面，丝状真菌宿主细胞是黑刺烟管菌(Bjerkandera adusta)、Ceriporiopsis aneirina、Ceriporiopsis aneirina、Ceriporiopsis caregiea、Ceriporiopsis gilvescens、Ceriporiopsis pannocinta、Ceriporiopsis rivulosa、Ceriporiopsis subrufa、Ceriporiopsis subvermispora、嗜角质金孢子菌、Chrysosporium lucknowense、热带金孢子菌、Chrysosporiummerdarium、Chrysosporium inops、毡金孢子菌、Chrysosporium queenslandicum、Chrysosporium zonatum、灰盖鬼伞(Coprinus cinereus)、毛革盖菌(Coriolushirsutus)、特异腐质霉、疏棉状腐质霉、米黑毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙脉孢菌、产紫青霉、黄孢平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、辐射射脉菌(Phlebiaradiata)、刺芹侧耳(Pleurotus eryngii)、土生梭孢霉、Trametes villosa、Trametesversicolor、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉或绿色木霉细胞。

可以将真菌细胞通过涉及原生质体形成、原生质体转化和细胞壁重建的方法以本身公知的方式转化。用于转化曲霉属和木霉属宿主细胞的合适方法在EP 238 023和Yelton等，1984，Proceedings of the National Academy ofSciences USA 81：1470-1474中描述。用于转化镰孢属菌种的合适方法由Malardier等，1989，Gene 78：147-156和WO 96/00787描述。可以使用由如下文献描述的方法转化酵母：Becker和Guarente，于Abelson，J.N.和Simon，M.I.编，Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology，Methods in Enzymology，Volume 194，182-187页，Academic Press，Inc.，New York；Ito等，1983，Journalof Bacteriology 153：163；和Hinnen等，1978，Proceedings of the NationalAcademy of Sciences USA 75：1920。

产生方法

本发明还涉及产生本发明多肽的方法，其包括：(a)在有助于产生多肽的条件下培养细胞，所述细胞以其野生型形式产生所述多肽；和(b)回收所述多肽。在一个优选的方面，所述细胞是毁丝霉属的。在更优选的方面，所述细胞是嗜热毁丝霉。在最优选的方面，所述细胞是嗜热毁丝霉CBS 117.65。

本发明还涉及产生本发明的多肽的方法，其包括：(a)在有助于产生多肽的条件下培养如本文所述的重组宿主细胞；和(b)回收所述多肽。

本发明还涉及产生本发明的多肽的方法，包括：(a)在有助于产生多肽的条件下培养重组宿主细胞，其中所述宿主细胞包含突变核苷酸序列，其在SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列中具有至少一个突变，其中所述突变核苷酸序列编码多肽，所述多肽包含SEQ ID NO：2的成熟多肽或由SEQ ID NO：2的成熟多肽组成，和(b)回收所述多肽。

在本发明的产生方法中，使用本领域熟知的方法在适合于产生所述多肽的营养培养基中培养细胞。例如，可以通过在合适培养基中和允许表达和/或分离所述多肽的条件下进行的摇瓶培养，和实验室或工业发酵罐中的小规模或大规模发酵(包括连续、分批、补料分批或固态发酵)来培养细胞。使用本领域已知的方法在合适的营养培养基中进行培养，所述营养培养基包含碳源和氮源和无机盐。合适的培养基能够从商业供应商获得或可以根据公开的组成制备(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)。如果多肽分泌到营养培养基中，该多肽能够从所述培养基中直接回收。如果多肽不分泌到培养基中，其能够从细胞裂解物(lysate)回收。

可以使用本领域已知的对于所述多肽是特异性的方法来检测多肽。这些检测方法可包括特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。例如，酶试验(enzyme assay)可用于测定如本文所述的多肽的活性。

所得多肽可以使用本领域已知的方法回收。例如，多肽可以通过常规方法从营养培养基中回收，所述常规方法包括但不限于离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀。

本发明的多肽可以通过多种本领域已知的方法纯化以获得基本上纯的多肽，所述方法包括但不限于层析(例如，离子交换、亲和、疏水、层析聚焦和大小排阻)、电泳方法(例如，制备型(preparative)等电聚焦)、差示溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE或提取(参见，例如，Protein Purification，J.-C.Janson和Lars Ryden编，VCH Publishers，New York，1989)。

植物

本发明还涉及植物，例如，转基因植物、植物部分或植物细胞，其包含分离的多核苷酸，所述多核苷酸编码本发明具有乙酰木聚糖酯酶活性的多肽，从而以可回收的量表达和产生所述多肽。多肽可从植物或植物部分回收。或者，同样可以将含有该重组多肽的植物或植物部分用于改进食品或饲料的质量，例如，改进营养价值、适口性(palatability)和流变性质(rheologicalproperties)，或用于破坏抗营养因子。

转基因植物可以是双子叶的(双子叶植物)或单子叶的(单子叶植物)。单子叶植物的实例是草(grasses)，如草地早熟禾(meadow grass)(蓝草(bluegrass)，早熟禾属(Poa))；饲用牧草(forage grass)如羊茅属(Festuca)、黑麦草属(Lolium)；寒地型牧草(temperate grass)，如Agrostis(翦股颖属)；和谷类，例如，小麦、燕麦、黑麦、大麦、稻(rice)、高粱和玉蜀黍(maize)(玉米)。

双子叶植物的实例是烟草(tobacco)，豆类(legumes)，如羽扇豆(lupins)，马铃薯，糖甜菜(sugar beet)，豌豆，豆(bean)和大豆(soybean)和十字花科的(cruciferous)植物(十字花科(family Brassicaceae))，如花椰菜(cauliflower)，油菜籽(rape seed)和紧密相关的模型生物体拟南芥(Arabidopsis thaliana)。

植物部分的实例是茎(stem)、愈伤组织(callus)、叶(leaf)、根(root)、果实(fruit)、种子(seed)和块茎(tuber)，以及包含这些部分的独立组织，例如，表皮(epidermis)、叶肉(mesophyll)、薄壁组织(parenchyme)、维管组织(vasculartissue)、分生组织(meristem)。具体的植物细胞区室(compartments)，如叶绿体(chloroplast)、质外体(apoplast)、线粒体(mitochondria)、液泡(vacuole)、过氧化物酶体(peroxisome)和细胞质(cytoplasm)也被认为是植物部分。此外，任何植物细胞，无论什么组织来源，都被认为是植物部分。同样地，植物部分，如为了促进本发明的应用而分离的具体组织和细胞也被认为是植物部分，例如胚(embryo)、胚乳(endosperm)、糊粉(aleurone)和种皮(seed coat)。

同样包含于本发明范围内的还有这些植物、植物部分和植物细胞的子代。

表达本发明多肽的转基因植物或植物细胞可以依照本领域已知方法构建。简而言之，通过如下方法构建所述植物或植物细胞：将编码本发明多肽的一个或多个(数个)表达构建体并入植物宿主基因组或叶绿体基因组，并且将所得的修饰植物或植物细胞繁殖为转基因植物或植物细胞。

表达构建体便利地是包含编码本发明多肽的多核苷酸的核酸构建体，所述多核苷酸与在选择的植物或植物部分中表达该核苷酸序列所需的适当的调节序列可操作地连接。此外，表达构建体可以包含对于鉴定在其中整合了该表达构建体的宿主细胞有用的选择性标记和将该构建体引入到所述植物中所必需的DNA序列(后者依赖于使用的DNA引入方法)。

调节序列的选择，例如启动子和终止子序列和任选地信号或转运序列的选择，举例来说，基于期望何时、何处以及如何表达多肽而确定。例如，编码本发明多肽的基因的表达可以是组成型的或诱导型的，或可以是发育、阶段或组织特异性的，并且基因产物可以靶向特定的组织或植物部分例如种子或叶。调节序列由例如Tague等，1988，Plant Physiology 86：506所述。

对于组成性表达，可以使用35S-CaMV、玉米泛素1和稻肌动蛋白1启动子(Franck等，1980，Cell 21：285-294，Christensen等，1992，Plant Mo.Biol.18：675-689；Zhang等，1991，Plant Cell 3：1155-1165)。器官特异性启动子可以是例如来自贮藏库组织(storage sink tissue)例如种子、马铃薯块茎和果实的启动子(Edwards and Coruzzi，1990，Ann.Rev.Genet.24：275-303)，或来自代谢库组织(metabolic sink tissue)例如分生组织的启动子(Ito等，1994，Plant Mol.Biol.24：863-878)，种子特异性启动子诸如来自稻的谷蛋白(glutelin)、醇溶蛋白(prolamin)、球蛋白(globulin)或白蛋白(albumin)启动子(Wu等，1998，Plant andCell Physiology 39：885-889)，来自豆球蛋白(legumin)B4和蚕豆(Vicia faba)的未知种子蛋白基因的蚕豆启动子(Conrad等，1998，Journal of Plant Physiology152：708-711)、来自种子油体蛋白(oil body protein)的启动子(Chen等，1998，Plantand Cell Physiology 39：935-941)，来自欧洲油菜(Brassica napus)的贮藏蛋白napA启动子，或本技术领域公知的任何其它种子特异性的启动子，例如，在WO 91/14772中所描述的。此外，启动子可为叶特异性的启动子，如来自稻或番茄的rbcs启动子(Kyozuka等，1993，Plant Physiology 102：991-1000)，小球藻病毒(chlorella virus)腺嘌呤甲基转移酶(adenine methyltransferase)基因启动子(Mitra和Higgins，1994，Plant Molecular Biology 26：85-93)，或来自稻的aldP基因启动子(Kagaya等，1995，Molecular and General Genetics 248：668-674)，或伤口诱导的启动子，如马铃薯pin2启动子(Xu等，1993，Plant Molecular Biology 22：573-588)。同样地，所述启动子可通过非生物的处理诱导，所述非生物的处理诸如温度、干旱或盐度变化，或通过外源施加的激活所述启动子的物质诱导，例如乙醇、雌激素(oestrogens)、植物激素(plant hormones)如乙烯、脱落酸(abscisicacid)和赤霉酸(gibberellic acid)，和重金属。

启动子增强子元件也可以用于实现本发明多肽在植物中的较高表达。例如，启动子增强子元件可以是内含子，其置于启动子和编码本发明多肽的核苷酸序列之间。例如Xu等，1993，见上，公开了使用稻肌动蛋白1基因的第一内含子以增强表达。

选择性标记基因和表达构建体的任何其它部分可以选自本领域内可用的那些。

将核酸构建体根据本领域已知的常规技术并入植物基因组，所述常规技术包括土壤杆菌属(Agrobacterium)介导的转化、病毒介导的转化、显微注射(microinjection)、粒子轰击、生物射弹转化和电穿孔(Gasser等，1990，Science244：1293；Potrykus，1990，Bio/Technology 8：535；Shimamoto等，1989，Nature338：274)。

目前，根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的基因转移(genetransfer)，是产生转基因双子叶植物的优选方法(为了参考，见Hooykas和Schilperoort，1992，Plant Molecular Biology 19：15-38)，而且它也可以用于转化单子叶植物，虽然对于这些植物常常使用其它的转化方法。目前，产生转基因单子叶植物的优选的方法，是用粒子(用转化DNA涂覆的微观的金或钨粒子)轰击胚愈伤组织(embryonic calli)或发育中的胚(developing embryos)(Christou，1992，Plant Journal 2：275-281；Shimamoto，1994，Current OpinionBiotechnology 5：158-162；Vasil等，1992，Bio/Technology 10：667-674)。转化单子叶植物的可供选择的方法是基于原生质体转化，如由Omirulleh等，1993，PlantMolecular Biology 21：415-428所描述的。

转化之后，根据本领域熟知的方法选择并入了表达构建体的转化体并且再生成为完整植株。通常设计转化方法用于通过如下方法在再生期间或在后续世代中选择性消除选择基因：例如，使用带有两种独立的T-DNA构建体的共转化或通过特异性重组酶位点特异性地切除选择基因。

本发明还涉及产生本发明多肽的方法，其包括：(a)在有助于产生多肽的条件下培养包含多核苷酸的转基因植物或植物细胞，所述多核苷酸编码本发明具有乙酰木聚糖酯酶活性的多肽；和(b)回收所述多肽。

去除或减少乙酰木聚糖酯酶活性

本发明还涉及产生亲本细胞突变体的方法，其包括破坏或缺失编码本发明的多肽的多核苷酸或其部分，这导致在相同条件下培养时，与亲本细胞相比突变的细胞产生较少的所述多肽。

可以使用本领域熟知的方法通过减少或消除编码本发明多肽的核苷酸序列的表达来构建突变细胞，所述方法例如，插入、破坏、替代或缺失。在一个优选的方面，所述核苷酸序列是被失活的。待修饰或失活的核苷酸序列可以是，例如，编码区或其中对活性关键的部分，或表达编码区所需的调节元件。这种调节或调控序列的实例可以是启动子序列或其功能部分，即，足以影响核苷酸序列表达的部分。用于可能的修饰的其它调控序列包括但不限于前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、信号肽序列、转录终止子和转录激活子。

核苷酸序列的修饰或失活可以通过向亲本细胞施以诱变，并且选择其中已将所述核苷酸序列的表达减少或消除的突变细胞来进行。诱变可能是特异性的或随机的，可以通过例如使用合适的物理或化学诱变剂进行，通过使用合适的寡核苷酸进行，或通过将所述DNA序列进行PCR产生的诱变。此外，可以通过使用这些诱变剂的任何组合来进行诱变。

适合于本发明目的的物理或化学诱变剂的实例包括紫外线(UV)照射、羟胺、N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)、O-甲基羟胺、亚硝酸、乙基甲烷磺酸酯(ethyl methane sulphonate)(EMS)、亚硫酸氢钠、甲酸和核苷酸类似物。

当使用这些试剂时，通常通过如下方法来进行所述诱变：在合适条件下存在优选的诱变剂时温育待诱变的亲本细胞，并筛选和/或选择显示基因表达减少的或无基因表达的突变体细胞。

通过导入、取代或去除基因中的一个或多个(数个)核苷酸或其转录或翻译所需的调节元件可以实现所述核苷酸序列的修饰或失活。例如，可以插入或去除核苷酸从而导致引入终止密码子，去除起始密码子，或改变开放阅读框。按照本领域已知的方法通过定位诱变或PCR产生的诱变可以实现这种修饰或失活。尽管在理论上所述修饰可以在体内进行，即，直接对表达待修饰核苷酸序列的细胞进行，但优选如下面所例示的那样在体外进行所述修饰。

消除或减少核苷酸序列通过细胞表达的便利方式的例子是基于基因替代，基因缺失，或基因破坏的技术。例如，在基因破坏方法中，将相应于内源核苷酸序列的核酸序列在体外进行诱变以产生缺陷性的核酸序列，然后将其转化入亲本细胞中以产生缺陷基因。通过同源重组，所述缺陷性核酸序列替代了内源性核苷酸序列。可能理想的是所述缺陷性核苷酸序列还编码标记，其可用于选择其中核苷酸序列被修饰或破坏的转化子。在特别优选的方面，用可选择的标记(如本文所述的那些)来破坏所述核苷酸序列。

或者，可以使用与所述核苷酸序列互补的序列通过确定的反义或RNAi技术来进行所述核苷酸序列的修饰或失活。更具体地，通过导入与所述基因的核苷酸序列互补的序列可以减少或消除所述核苷酸序列通过细胞的表达，所述互补序列可以在细胞中转录并且能够与细胞中产生的mRNA杂交。在允许所述互补反义核苷酸序列与mRNA杂交的条件下，由此减少或消除翻译的蛋白质的量。

本发明进一步涉及亲本细胞的突变体细胞，其包含编码多肽的核苷酸序列或其调控序列的破坏或缺失，这导致与亲本细胞相比突变体细胞产生更少的多肽或不产生多肽。

这样生成的多肽缺陷型突变体细胞作为表达天然和/或异源多肽的宿主细胞特别有用。所以，本发明进一步涉及产生天然或异源多肽的方法，其包括：(a)在有助于产生多肽的条件下培养突变体细胞；和(b)回收所述多肽。术语“异源多肽”在本文中定义为对宿主细胞不是天然的多肽，进行了修饰以改变天然序列的天然蛋白，或作为通过重组DNA技术对宿主细胞操作的结果其表达在量上改变的天然蛋白。

在另一方面，本发明涉及通过发酵产生本发明的多肽以及目标蛋白产物的细胞来生产基本上无乙酰木聚糖酯酶活性的蛋白质产物的方法，通过在发酵之前、之中或发酵完成之后向发酵液(fermentation broth)中添加有效量的能够抑制乙酰木聚糖酯酶活性的试剂，从发酵液中回收目标产物，并且任选地将回收的产物进行进一步纯化。

在另一方面，本发明涉及通过如下生产基本上无乙酰木聚糖酯酶活性的蛋白质产物的方法：在允许产物表达的条件下培养细胞，将得到的培养液进行组合的pH和温度处理以实质上(substantially)减少乙酰木聚糖酯酶活性，和从发酵液中回收产物。或者，可以将从培养液回收的酶制备物进行组合的pH和温度处理。所述组合的pH和温度处理可任选地与乙酰木聚糖酯酶抑制剂处理组合使用。

依照本发明的这个方面，可能去除至少60％，优选至少75％，更优选至少85％，还更优选至少95％，并且最优选至少99％的乙酰木聚糖酯酶活性。可使用此方法获得乙酰木聚糖酯酶活性的完全去除。

组合的pH和温度处理优选在2-4或9-11范围内的pH和至少60-70℃范围内的温度进行一段足够的时间以达到期望的效果，通常30至60分钟是足够的。

用于培养和纯化感兴趣的产物的方法可以通过本领域已知的方法进行。

本发明用于产生基本上无α-葡糖醛酸糖苷酶的产物的方法在真核多肽，特别是真菌蛋白质例如酶的产生中是特别令人有兴趣的。所述酶可以选自，例如，淀粉分解酶(amylolytic enzyme)、脂肪分解酶、蛋白水解酶、纤维素分解酶(cellulolytic enzyme)、氧化还原酶或植物细胞壁降解酶。这些酶的实例包括氨肽酶、淀粉酶、淀粉葡糖苷酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、几丁质酶(chitinase)、角质酶(cutinase)、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、内切葡聚糖酶、酯酶、半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、葡糖氧化酶、葡糖苷酶、卤素过氧化酶、半纤维素酶、转化酶、异构酶、漆酶、连接酶、脂肪酶、裂合酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、肌醇六磷酸酶、酚氧化酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转移酶、转谷氨酰胺酶或木聚糖酶。α-葡糖醛酸糖苷酶缺陷细胞也可以用于表达在制药上引起兴趣的异源蛋白如激素、生长因子、受体等。

可理解的是术语“真核多肽”不仅包括天然多肽，也包括通过氨基酸取代、缺失或添加或其它这样的修饰而被修饰以增强活性、热稳定性、pH耐受性等的多肽，例如酶。

在另外的方面，本发明涉及基本上无乙酰木聚糖酯酶活性的蛋白质产物，其是通过本发明的方法产生的。

抑制具有乙酰木聚糖酯酶活性的多肽表达的方法

本发明还涉及抑制具有乙酰木聚糖酯酶活性的多肽在细胞中表达的方法，其包括对所述细胞施用双链RNA(dsRNA)分子或者在所述细胞中表达双链RNA(dsRNA)分子，其中所述dsRNA包含本发明多核苷酸的亚序列。在一个优选的方面，dsRNA长约15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多的双链体核苷酸。

dsRNA优选是小干扰RNA(siRNA)或微RNA(miRNA)。在一个优选的方面，dsRNA是用于抑制转录的小干扰RNA(siRNA)。在另一优选的方面，dsRNA是用于抑制翻译的微RNA(miRNA)。

本发明还涉及这样的双链RNA(dsRNA)分子，其包含SEQ ID NO：1成熟多肽编码序列的部分，用于抑制细胞中的多肽表达。虽然本发明不受限于任何特定作用机制，但dsRNA能进入细胞，并引起相似或相同序列的单链RNA(ssRNA)的降解，所述RNA包括内源mRNA。当细胞接触dsRNA时，来自同源基因的mRNA选择性地受到称为RNA干扰(RNAi)的过程的降解。

本发明的dsRNA可以用于基因沉默。在一个方面，本发明提供使用本发明的dsRNAi选择性地降解RNA的方法。所述方法可以在体外、回体(ex vivo)或在体内进行。在一个方面，dsRNA分子能够用于在细胞、器官或动物中产生功能丧失突变(loss-of-function mutation)。制备和使用选择性降解RNA的dsRNA分子的方法在本领域中公知，参见，例如，美国专利号6,506,559；美国专利号6,511,824；美国专利号6,515,109；和美国专利号6,489,127。

组合物

本发明还涉及包含本发明的多肽的组合物。优选地，所述组合物富含这种多肽。术语“富含”表示所述组合物的乙酰木聚糖酯酶活性得到了增加，例如，以至少1.1的富集因数(enrichment factor)增加。

所述组合物可以包含本发明的多肽作为主要酶成分，例如，单成分组合物。或者，所述组合物可以包含多种酶活性，例如氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、卤素过氧化物酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果胶分解酶、肽谷氨酰胺酶(peptidoglutaminase)、过氧化物酶、肌醇六磷酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶或木聚糖酶。额外的酶可以通过例如属于以下属或种的微生物产生：曲霉属，优选棘孢曲霉、泡盛曲霉、烟曲霉、臭曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉或米曲霉；镰孢属，优选杆孢状镰孢、禾谷镰孢、库威镰孢、大刀镰孢、禾本科镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰孢或镶片镰孢；腐质霉属，优选特异腐质霉或疏棉状腐质霉；或木霉属，优选哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉或绿色木霉。

可以依照本领域内已知的方法制备多肽组合物，并且可以是液体或干组合物的形式。例如，所述多肽组合物可以是颗粒(granulate)或微粒(microgranulate)的形式。可以依照本领域内已知方法将包括于所述组合物中的多肽稳定化。

下面给出的是本发明多肽组合物的优选用途的实例。本发明的多肽组合物的剂量和使用该组合物的其它条件可以基于本领域内已知的方法确定。

用途

本发明还涉及使用具有乙酰木聚糖酯酶活性的多肽或其组合物的方法。本发明的多肽可用于降解或转化植物细胞壁或任何含木聚糖材料，例如，木素纤维素，其来源于植物细胞壁(参见，例如，WO 2002/18561)。多种用途的实例如下所述。本发明多肽的剂量和其他使用所述多肽的条件可基于本领域已知的方法确定。

全部或部分去除侧链促进含木聚糖材料的酶降解。本发明的多肽优选与其他木聚糖降解酶，如木聚糖酶、乙酰木聚糖酯酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、木糖苷酶、阿魏酸酯酶、葡糖醛酸糖苷酶及其组合一同用于其中含木聚糖材料受降解的方法。举例而言，乙酰基基团可由乙酰木聚糖酯酶去除；阿拉伯糖基团可由α-阿拉伯糖苷酶去除；阿魏酰基团可由阿魏酸酯酶去除，而葡糖醛酸基团可由α-葡糖醛酸糖苷酶去除。作为脱乙酰基反应的结果，所述木聚糖变得对于木聚糖酶和其他木聚糖降解酶更可接近(accessible)。由木聚糖酶，或木聚糖酶和侧链水解酶释放的寡聚物可由β-木糖苷酶进一步降解为游离木糖。

本发明还涉及降解或转化纤维素材料或含木聚糖材料的方法，包括：用酶组合物在本发明的具有乙酰木聚糖酯酶活性的多肽存在下处理所述纤维素材料或含木聚糖材料。在一个优选的方面，所述方法还包括回收降解的或转化的纤维素材料或含木聚糖材料。

本发明还涉及产生发酵产物的方法，包括：(a)用酶组合物在本发明具有的乙酰木聚糖酯酶活性的多肽存在下糖化纤维素材料或含木聚糖材料；(b)用一种或多种发酵微生物发酵经糖化的纤维素材料或含木聚糖材料以产生发酵产物；和(c)从发酵回收发酵产物。

本发明还涉及发酵纤维素材料或含木聚糖材料的方法，包括：用一种或多种发酵微生物发酵所述纤维素材料或含木聚糖材料，其中将所述纤维素材料或含木聚糖材料用酶组合物在本发明具有乙酰木聚糖酯酶活性的多肽存在下糖化。在一个优选的方面，所述纤维素材料或含木聚糖材料的发酵产生了发酵产物。在另一优选的方面，所述方法还包括从发酵回收所述发酵产物。

本发明的方法可用于将纤维素材料或含木聚糖材料糖化为可发酵的糖，并将所述可发酵的糖转化为许多有用的物质，例如，燃料、饮用乙醇和/或发酵产物(例如，酸、醇、酮、气体等)。自所述纤维素材料或含木聚糖材料产生所期望的发酵产物通常涉及预处理，酶法水解(糖化)和发酵。

根据本发明对所述纤维素材料或含木聚糖材料的加工可使用本领域常规方法完成。而且，本发明的方法可使用任何经配置以依照本发明操作的常规生物质加工装置来执行。

分别或同时的水解(糖化)和发酵包括但不限于：分别水解和发酵(SHF)；同时糖化和发酵(SSF)；同时糖化和共发酵(SSCF)；混合水解和发酵(HHF)；分别水解和共发酵(SHCF)；混合水解和共发酵(HHCF)，以及直接微生物转化(DMC)。SHF使用分别的过程步骤以首先将纤维素材料或含木聚糖材料酶法水解为可发酵的糖，例如，葡萄糖，纤维二糖，纤维三糖与戊糖，然后将所述可发酵的糖发酵为乙醇。在SSF中，纤维素材料或含木聚糖材料的酶法水解，以及糖发酵为乙醇合并为一步(Philippidis，G.P.，1996，Cellulosebioconversion technology，于Handbook on Bioethanol：Production andUtilization，Wyman，C.E.编，Taylor & Francis，Washington，DC，179-212)。SSCF涉及多种糖类的共发酵(Sheehan，J.和Himmel，M.，1999，Enzymes，energy andthe environment：A straegic perspective on the U.S.Department of Energy’sresearch and development activities for bioethanol，Biotechnol.Prog.15：817-827)。HHF涉及分别的水解步骤，并另外涉及同时的糖化和水解步骤，其可在同一个反应器中进行。在HHF过程中的步骤可在不同温度进行，即，高温酶法糖化然后是在发酵菌株可容忍的较低温度的SSF。DMC将所有三个过程(酶产生，水解与发酵)合并于一个或多个步骤，其中使用相同生物体来产生酶用于将纤维素材料或含木聚糖材料转化为可发酵的糖并将所述可发酵的糖转化为终产物(Lynd，L.R.，Weimer，P.J.，van Zyl，W.H.和Pretorius，I.S.，2002，Microbial cellulose utilization：Fundamentals and biotechnology，Microbiol.Mol.Biol.Reviews 66：506-577)。在本文中应理解，包括预处理，酶法水解(糖化)，发酵或其组合的本领域已知的任何方法可用于实施本发明的方法。

常规装置可包括补料分批搅拌反应器(fed-batch stirred reactor)，分批搅拌反应器(batch stirred reactor)，带超滤的连续流搅拌反应器(continuous flowstirred reactor with ultrafiltration)和/或连续的活塞流柱式反应器(continuousplug-flow column reactor)(Fernanda de Castilhos Corazza，Flávio Faria de Moraes，Gisella Maria Zanin和Ivo Neitzel，2003，Optimal control in fed-batch reactor forthe cellobiose hydrolysis，Acta Scientiarum.Technology 25：33-38；Gusakov，A.V.和Sinitsyn，A.P.，1985，Kinetics of the enzymatic hydrolysis of cellulose：1.Amathematical model for a batch reactor process，Enz.Microb.Technol.7：346-352)，磨耗反应器(an attrition reactor)(Ryu，S.K.和Lee，J.M.，1983，Bioconversion of waste cellulose by using an attrition bioreactor，Biotechnol.Bioeng.25：53-65)，或者带有由电磁场诱导的强搅拌的反应器(a reactor withintensive stirring induced by an electromagnetic field)(Gusakov，A.V.，Sinitsyn，A.P.，Davydkin，I.Y.，Davydkin，V.Y.，Protas，O.V.，1996，Enhancement ofenzymatic cellulose hydrolysis using a novel type of bioreactor with intensivestirring induced by electromagnetic field，Appl.Biochem.Biotechnol.56：141-153)。其它类型的反应器包括：流化床(fluidized bed)、上流床(upflowblanket)、固定化的以及挤出机(extruder)型反应器以供水解和/或发酵。

预处理在实施本发明的方法时，本领域已知的任何预处理方法可用于破坏植物细胞壁的纤维素材料和/或含木聚糖材料组分(Chandra等，2007，Substrate pretreatment：The key to effective enzymatic hydrolysis oflignocellulosics？Adv.Biochem.Engin./Biotechnol.108：67-93；Galbe和Zacchi，2007，Pretreatment of lignocellulosic materials for efficient bioethanol production，Adv.Biochem.Engin./Biotechnol.108：41-65；Hendriks和Zeeman，2009，Pretreatments to enhance the digestibility of lignocellulosic biomass，BioresourceTechnol.100：10-18；Mosier等，2005，Features of promising technologies forpretreatment of lignocellulosic biomass，Bioresource Technol.96：673-686；Taherzadeh和Karimi，2008，Pretreatment of lignocellulosic wastes to improveethanol and biogas production：A review，Int.J.of Mol.Sci.9：1621-1651；Yang和Wyman，2008，Pretreatment：the key to unlocking low-cost cellulosic ethanol，Biofuels Bioproducts and Biorefining-Biofpr.2：26-40)。

还可在使用本领域已知方法进行预处理之前对纤维素材料和含木聚糖材料进行粒度减少(particle size reduction)、预浸(pre-soaking)，润湿(wetting)，洗涤或调理(conditioning)。

常规预处理包括但不限于，蒸汽预处理(爆炸或不爆炸)，稀酸预处理，热水预处理，碱性预处理，石灰预处理，湿氧化，湿爆炸，氨纤维爆炸，有机溶剂预处理以及生物预处理。其它预处理包括氨渗滤、超声、电穿孔、微波、超临界CO₂、超临界H₂O、臭氧和γ辐射预处理。

纤维素材料或含木聚糖材料可在水解和/或发酵前进行预处理。预处理优选在水解前进行。或者，所述预处理可与酶水解同时进行以释放可发酵的糖，如葡萄糖、木糖和/或纤维二糖。在多数情况下，所述预处理步骤本身导致生物质部分转化为可发酵的糖(甚至酶不存在时亦如此)。

蒸汽预处理。在蒸汽预处理中，将纤维素材料或含木聚糖材料加热以破坏其植物细胞壁组分(包括木质素、半纤维素和纤维素)，以使纤维素与其它部分(例如，半纤维素)易受酶作用(accessible to enzymes)。使纤维素材料或含木聚糖材料传递至或经过反应容器，在该反应容器中注入蒸汽以将温度增加至所需温度和压力，并在其中保持到所期望的反应时间。蒸汽预处理优选在140-230℃，更优选160-200℃，且最优选170-190℃进行，其中最佳温度范围取决于任何化学催化剂的添加。蒸汽预处理的停留时间优选为1-15分钟，更优选为3-12分钟，且最优选为4-10分钟，其中最佳停留时间取决于温度范围和任何化学催化剂的添加。蒸汽预处理允许相对较高的固体加载(量)，从而使得纤维素材料或含木聚糖材料通常仅在预处理过程中为潮湿的。所述蒸汽预处理常常与预处理之后材料的爆炸性排出(explosive discharge)组合，其称为蒸汽爆炸，即，所述材料迅速闪蒸至大气压力和湍流以通过碎裂增加其可接触表面积(Duff和Murray，1996，Bioresource Technology 855：1-33；Galbe和Zacchi，2002，Appl.Microbiol.Biotechnol.59：618-628；美国专利申请No.20020164730)。在蒸汽预处理过程中，半纤维素乙酰基团遭剪切，且所得的酸自催化半纤维素部分水解为单糖与寡糖。仅有限程度地去除木质素。

常常在蒸汽预处理前添加催化剂如H₂SO₄或SO₂(通常为0.3到3％w/w)，其减少时间与温度，增加回收(率)，并改善酶法水解(Ballesteros等，2006，Appl.Biochem.Biotechnol.129-132：496-508；Varga等，2004，Appl.Biochem.Biotechnol.113-116：509-523；Sassner等，2006，Enzyme Microb.Technol.39：756-762)。

化学预处理：术语“化学预处理”指任何促进纤维素、半纤维素和/或木质素分离和/或释放的化学预处理。合适的化学预处理过程的实例包括，例如，稀酸预处理、石灰预处理、湿氧化、氨纤维/冷冻爆炸(ammonia fiber/freezeexplosion，AFEX)、氨渗滤(APR)以及有机溶剂预处理。

在稀酸预处理中，将纤维素材料或含木聚糖材料与稀酸，通常为H₂SO₄，以及水混合以形成浆料，由蒸汽加热至所期望的温度，并在停留时间后闪蒸至大气压力。所述稀酸预处理可用多种设计的反应器来实施，例如，活塞流反应器，逆流反应器(counter-current reactor)或连续逆流收缩床反应器(continuous counter-current shrinking bed reactor)(Duff和Murray，1996，见上文；Schell等，2004，Bioresource Technol.91：179-188；Lee等，1999，Adv.Biochem.Eng.Biotechnol.65：93-115)。

亦可使用数种碱性条件下的预处理方法。这些碱性预处理包括但不限于，石灰预处理、湿氧化、氨渗滤(APR)与氨纤维/冷冻爆炸(AFEX)。

石灰预处理使用碳酸钙，氢氧化钠或氨在85-150℃的低温以及1小时到数日的停留时间进行(Wyman等，2005，Bioresource Technol.96：1959-1966；Mosier等，2005，Bioresource Technol.96：673-686)。WO 2006/110891、WO 2006/110899、WO 2006/110900和WO 2006/110901公开了使用氨的预处理方法。

湿氧化为如下的热预处理，即其通常在180-200℃进行5-15分钟，加以氧化剂如过氧化氢或氧气超压(over-pressure)(Schmidt和Thomsen，1998，Bioresource Technol.64：139-151；Palonen等，2004，Appl.Biochem.Biotechnol.117：1-17；Varga等，2004，Biotechnol.Bioeng.88：567-574；Martin等，2006，J.Chem.Technol.Biotechnol.81：1669-1677)。该预处理优选以1-40％干物质，更优选2-30％干物质，且最优选5-20％干物质进行，且起始pH常常通过添加碱性物质(如碳酸钠)来增加。

所述湿氧化预处理方法的改进，称为湿爆炸(湿氧化与蒸汽爆炸的组合)，可处理多达30％的干物质。在湿爆炸中，氧化剂在预处理过程中在一定停留时间后导入。然后所述预处理通过闪蒸至大气压力来终止(WO 2006/032282)。

氨纤维爆炸(AFEX)涉及用液态或气态氨在中等温度(如90-100℃)以及高压(如17-20巴)对纤维素材料或含木聚糖材料处理5-10分钟，其中干物质含量可高达60％(Gollapalli等，2002，Appl.Biochem.Biotechnol.98：23-35；Chundawat等，2007，Biotechnol.Bioeng.96：219-231；Alizadeh等，2005，Appl.Biochem.Biotechnol.121：1133-1141；Teymouri等，2005，Bioresource Technol.96：2014-2018)。AFEX预处理导致纤维素的解聚和半纤维素的部分水解。木质素-碳水化合物复合物被剪切。

有机溶剂预处理通过用乙醇水溶液(40-60％乙醇)在160-200℃提取30-60分钟而使纤维素材料或含木聚糖材料脱木质化(Pan等，2005，Biotechnol.Bioeng.90：473-481；Pan等，2006，Biotechnol.Bioeng.94：851-861；Kurabi等，2005，Appl.Biochem.Biotechnol.121：219-230)。通常添加硫酸作为催化剂。在有机溶剂预处理中，大部分半纤维素得到去除。

合适的预处理方法的其它实例由Schell等，2003，Appl.Biochem.andBiotechnol.Vol.105-108，p.69-85与Mosier等，2005，Bioresource Technology 96：673-686，以及公布的美国申请2002/0164730描述。

在一方面，所述化学预处理优选作为酸处理来进行，且更优选作为连续性稀酸和/或弱酸(mild acid)处理进行。所述酸通常为硫酸，但亦可使用其它酸，如乙酸、柠檬酸、硝酸、磷酸、酒石酸、琥珀酸、盐酸或其混合物。弱酸处理在pH范围优选为1-5，更优选为1-4，且最优选为1-3进行。在一个方面，所述酸浓度范围为优选0.01到20wt％的酸，更优选0.05到10wt％的酸，甚至更优选0.1到5wt％的酸，且最优选0.2到2.0wt％的酸。所述酸与纤维素材料或含木聚糖材料接触，并在范围优选为160-220℃，且更优选为165-195℃的温度保持数秒至数分钟范围的时间，例如，1秒到60分钟。

在另一方面，预处理作为氨纤维爆炸步骤(AFEX预处理步骤)进行。

在另一方面，预处理在含水浆料中进行。在一个优选的方面，纤维素材料或含木聚糖材料在预处理过程中以优选为10-80wt％，更优选为20-70wt％，且最优选为30-60wt％，例如约50wt％的量存在。经预处理的纤维素材料或含木聚糖材料可不经洗涤，或使用任何本领域已知的方法洗涤，例如，用水洗涤。

机械预处理：术语“机械预处理”指不同类型的碾磨或磨制(grinding ormilling)(例如，干磨、湿磨或振动球磨(vibratory ball milling))。

物理预处理：术语“物理预处理”指任何促进自纤维素材料或含木聚糖材料分离和/或释放纤维素，半纤维素和/或木质素的预处理。例如，物理预处理可涉及辐射(例如，微波辐射)、汽蒸/蒸汽爆炸、水热解以及其组合。

物理预处理可涉及高压和/或高温(蒸汽爆炸)。在一方面，高压意为范围在优选约300到约600psi，更优选约350到约550psi，且最优选约400到约500psi，例如约450psi的压力。在另一方面，高温意为范围在约100到约300℃，优选约140到约235℃的温度。在一个优选方面，机械预处理以分批过程在蒸汽枪水解仪系统中进行，所述系统使用如上所述定义的高压与高温，例如，可自Sunds Defibrator AB，Sweden得到的Sunds Hydrolyzer。

组合的物理和化学预处理：纤维素材料或含木聚糖材料可经物理与化学方法两者预处理。例如，所述预处理步骤可涉及稀酸或弱酸处理以及高温和/或高压处理。物理与化学预处理可视需要顺序或同时进行。亦可包含机械预处理。

因此，在一个优选方面，可对纤维素材料或含木聚糖材料进行机械、化学或物理预处理，或其任意组合以促进纤维素、半纤维素和/或木质素的分离和/或释放。

生物预处理：术语“生物预处理”指任何促进自纤维素材料或含木聚糖材料分离和/或释放纤维素、半纤维素和/或木质素的生物预处理。生物预处理技术可涉及应用溶解木质素的微生物(参见，例如，Hsu，T.-A.，1996，Pretreatment ofbiomass，于Handbook on Bioethanol：Production and Utilization，Wyman，C.E.编，Taylor&Francis，Washington，DC，179-212；Ghosh和Singh，1993，Physicochemicaland biological treatments for enzymatic/microbial conversion of cellulosic biomass，Adv.Appl.Microbiol.39：295-333；McMillan，J.D.，1994，Pretreating lignocellulosicbiomass：a review，于Enzymatic Conversion of Biomass for Fuels Production，Himmel，M.E.，Baker，J.O.和Overend，R.P.编，ACS Symposium Series 566，American Chemical Society，Washington，DC，第15章；Gong，C.S.，Cao，N.J.，Du，J.和Tsao，G.T.，1999，Ethanol production from renewable resources，于Advances inBiochemical Engineering/Biotechnology，Scheper，T.编，Springer-Verlag BerlinHeidelberg，Germany，65：207-241；Olsson和Hahn-Hagerdal，1996，Fermentation oflignocellulosic hydrolysates for ethanol production，Enz.Microb.Tech.18：312-331；和Vallander和Eriksson，1990，Production of ethanol from lignocellulosic materials：State of the art，Adv.Biochem.Eng./Biotechnol.42：63-95)。

糖化在亦称为糖化的水解步骤中，将经预处理的纤维素材料或含木聚糖材料水解以将纤维素和半纤维素分解为可发酵的糖，如葡萄糖、纤维二糖、木糖、木酮糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖和/或可溶性寡糖。所述水解用酶法通过酶组合物在本发明具有乙酰木聚糖酯酶活性的多肽存在下进行。该组合物中的酶亦可顺序添加。

酶水解优选在合适的水溶液环境中在本领域技术人员可容易地确定的条件下进行。在一个优选方面，水解在适于所述酶活性，即，对于所述酶为最佳的条件下进行。所述水解可作为分批补料或连续工艺进行，在后者中将经预处理的纤维素材料或含木聚糖材料(底物)逐渐进料至，例如，含有酶的水解溶液中。

所述糖化通常在搅拌釜式反应器或发酵罐中在受控的pH、温度和混合条件下进行。合适的过程时间、温度与pH条件可由本领域技术人员容易地确定。例如，所述糖化可持续长达200小时，但通常优选进行约12至约96小时，更优选约16至约72小时，且最优选约24至约48小时。温度范围优选为约25℃至约70℃，更优选约30℃至约65℃，且最优选约40℃至60℃，特别是约50℃。pH范围优选为约3至约8，更优选约3.5至约7，且最优选约4至约6，特别为约pH5。干固形物含量范围优选为约5至约50wt％，更优选约10至约40wt％，且最优选约20至约30wt％。

所述酶组合物优选包含具有纤维素分解活性和/或木聚糖降解活性的酶。在一个方面，所述酶组合物包含一种或多种木聚糖降解酶。在另一方面，所述酶组合物包含一种或多种纤维素分解酶。在另一方面，所述酶组合物包含一种或多种木聚糖降解酶和一种或多种纤维素分解酶。

所述一种或多种木聚糖降解酶优选选自下组：木聚糖酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、木糖苷酶和葡糖醛酸糖苷酶。所述一种或多种纤维素分解酶优选选自下组：内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶。

在另一方面，所述酶组合物还或甚至还包含具有纤维素分解增强活性的多肽(参见，例如，WO 2005/074647，WO 2005/074656和WO 2007/089290)。在另一方面，所述酶组合物还可或甚至还可包含一种或多种其它的酶活性以改进含纤维素材料的降解。优选的其它酶为半纤维素酶(例如，α-D-葡糖醛酸糖苷酶、α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、内切甘露聚糖酶、β-甘露糖苷酶、α-半乳糖苷酶、内切α-L-阿拉伯聚糖酶、β-半乳糖苷酶)、糖酯酶(例如，乙酰木聚糖酯酶、乙酰甘露聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、香豆酸酯酶、葡糖醛酸酯酶)、果胶酶、蛋白酶、木素分解酶(例如，漆酶、锰过氧化物酶、木素过氧化物酶、H₂O₂产生酶、氧化还原酶)、棒曲霉素(expansin)、swollenin(膨胀素)或其混合物。在本发明的方法中，所述其它的酶可在发酵过程之前或之中添加，例如，在糖化中添加，或在所述发酵生物繁殖过程中或之后添加。

所述酶组合物的一种或多种组分可为野生型蛋白质、重组蛋白质或野生型蛋白质与重组蛋白质的组合。例如，一种或多种组分可为细胞的天然蛋白质，所述细胞用作宿主细胞以重组表达酶组合物的一个或多个(几个)其它组分。所述酶组合物的一种或多种组分可作为单组分产生，然后将其组合以形成所述酶组合物。所述酶组合物可为多组分和单组分蛋白质制备物的组合。

用于本发明方法的酶可为任何适用于本文中所述方法的形式，例如，去除或未去除细胞的粗发酵液，半纯化的或纯化的酶制备物，或作为酶的来源的宿主细胞。所述酶组合物可为干粉或粒状物、无粉尘的粒状物、液体、稳定化的液体或稳定化的受保护的酶。液体酶制备物可，例如，根据已确立的方法通过添加稳定剂来稳定化，所述稳定剂如糖、糖醇或其它多元醇，和/或乳酸或其它有机酸。

所述具有乙酰木聚糖酯酶活性的多肽和酶的最优的量取决于几种因素，包括但不限于，组分纤维素分解酶的混合物，所述纤维素材料或含木聚糖材料，所述纤维素材料或含木聚糖材料的浓度，所述纤维素材料或含木聚糖材料的预处理，温度，时间，pH和包含发酵生物(例如，供同时糖化和发酵的酵母)。

在一个优选的方面，对于纤维素材料或含木聚糖材料的纤维素分解酶和/或木聚糖降解酶的有效量为每g纤维素材料或含木聚糖材料约0.5至约50mg，优选约0.5至约40mg，更优选约0.5至约25mg，更优选约0.75至约20mg，更优选约0.75至约15mg，甚至更优选约0.5至约10mg，且最优选约2.5至约10mg。

在另一个优选的方面，具有乙酰木聚糖酯酶活性的多肽对于纤维素材料或含木聚糖材料的有效量为每g纤维素材料或含木聚糖材料约0.01至约50.0mg，优选约0.01至约40mg，更优选约0.01至约30mg，更优选约0.01至约20mg，更优选约0.01至约10mg，更优选约0.01至约5mg，更优选约0.025至约1.5mg，更优选约0.05至约1.25mg，更优选约0.075至约1.25mg，更优选约0.1至约1.25mg，甚至更优选约0.15至约1.25mg，且最优选约0.25至约1.0mg。

在另一个优选的方面，具有乙酰木聚糖酯酶活性的多肽对于纤维素分解酶和/或木聚糖降解酶的有效量为每g纤维素分解酶约0.005至约1.0g，优选约0.01至约1.0g，更优选约0.15至约0.75g，更优选约0.15至约0.5g，更优选约0.1至约0.5g，更优选约0.1至约0.5g，且最优选约0.05至约0.2g。

所述酶可源自或得自任何合适的来源，包括细菌、真菌、酵母、植物或哺乳动物来源。在本文中术语“获得”指该酶可分离自天然产生该酶作为天然酶的生物。在本文中术语“获得”也指所述酶可在宿主生物中使用本文所描述的方法重组产生，其中所述重组产生的酶对于所述宿主生物可为天然的或外源的，或具有修饰的氨基酸序列，例如，具有一个或多个缺失、插入和/或取代的氨基酸的修饰的氨基酸序列，即，重组产生的酶，其为天然氨基酸序列的突变体和/或片段，或者其为通过本领域已知的核酸改组方法(nucleic acid shufflingprocess)产生的酶。天然酶含意中涵盖天然变体，而外源酶含意中涵盖重组获得的变体，例如，通过定位诱变或改组获得的变体。

具有纤维素分解酶活性或木聚糖降解活性的多肽可为细菌多肽，例如，所述多肽可为革兰氏阳性菌多肽，如具有纤维素分解酶活性或木聚糖降解活性的芽孢杆菌属、链球菌属、链霉菌属、葡萄球菌属、肠球菌属、乳杆菌属、乳球菌属、梭菌属、地芽孢杆菌属和海洋芽孢杆菌属多肽，或革兰氏阴性菌多肽，如具有纤维素分解酶活性或木聚糖降解活性的大肠杆菌、假单胞菌属、沙门氏菌属、弯曲杆菌属、螺杆菌属、黄杆菌属、梭杆菌属、泥杆菌属、奈瑟氏菌属和脲原体属多肽。

在一个优选的方面，所述多肽是具有纤维素分解酶活性或木聚糖降解活性的嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌多肽。

在另一个优选的方面，所述多肽是具有纤维素分解酶活性或木聚糖降解活性的似马链球菌、酿脓链球菌、乳房链球菌和马链球菌兽瘟亚种多肽。

在另一个优选的方面，所述多肽是具有纤维素分解酶活性或木聚糖降解活性的不产色链霉菌、除虫链霉菌、天蓝色链霉菌、灰色链霉菌和浅青紫链霉菌多肽。

所述具有纤维素分解酶活性或木聚糖降解活性的多肽也可为真菌多肽，且更优选为酵母多肽，如具有纤维素分解酶活性或木聚糖降解活性的念珠菌属、克鲁维酵母属、毕赤酵母属、酵母属、裂殖酵母属或西洋蓍霉属多肽；或更优选为丝状真菌多肽，如具有纤维素分解酶活性或木聚糖降解活性的枝顶孢霉属、伞菌属、链格孢属、曲霉属、短梗霉属、Botryospaeria、拟蜡菌属、毛喙壳属、金孢子菌属、Claviceps、Cochliobolus、鬼伞属、Coptotermes、棒囊壳属、隐丛赤壳菌属、隐球菌属、色二孢属、黑耳属、Filibasidium、镰孢属、赤霉属、全鞭毛虫属、腐质霉属、耙齿菌属、蘑菇属、Leptospaeria、梨孢菌属、Melanocarpus、多孔菌属、毛霉属、毁丝霉属、新考玛脂霉属、脉孢菌属、拟青霉属、青霉属、平革菌属、瘤胃壶菌属、Poitrasia、假黑盘菌属、Pseudotrichonympha、根毛霉属、裂褶菌属、柱顶孢属、踝节菌属、嗜热子囊菌属/嗜热霉属、梭孢壳属、弯颈霉属、木霉属、长毛盘菌属、轮枝孢属、包脚菇属或炭角菌属多肽。

在一个优选的方面，所述多肽是具有纤维素分解酶活性或木聚糖降解活性的卡尔酵母、酿酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母、克鲁弗酵母、诺地酵母或卵形酵母多肽。

在另一个优选的方面，所述多肽是具有纤维素分解酶活性或木聚糖降解活性的解纤维枝顶孢霉、棘孢曲霉、泡盛曲霉、烟曲霉、臭曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、嗜角质金孢子菌、Chrysosporium lucknowense、热带金孢子菌、Chrysosporium merdarium、Chrysosporium inops、毡金孢子菌、Chrysosporium queenslandicum、Chrysosporium zonatum、杆孢状镰孢、禾谷镰孢、库威镰孢、大刀镰孢、禾本科镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰孢、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰孢、镶片镰孢、灰腐质霉、特异腐质霉、疏棉状腐质霉、白耙齿菌、米黑毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙脉孢菌、绳状青霉、产紫青霉、黄孢平革菌、Thielavia achromatica、Thielavia albomyces、Thielavia albopilosa、澳洲梭孢壳、Thielavia fimeti、小孢梭孢壳、卵孢梭孢壳、Thielavia peruviana、瘤孢梭孢壳、毛梭孢壳、Thielavia subthermophila、土生梭孢霉、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉、绿色木霉或Trichophaea saccata多肽。

也可使用具有纤维素分解酶活性或木聚糖降解活性的多肽的经化学修饰的或蛋白质工程改造的突变体。

所述酶组合物的一种或多种组分可为重组组分，即，通过克隆编码单一组分的DNA序列并随后用该DNA序列转化细胞并在宿主中表达而产生(参见，例如，WO 91/17243和WO 91/17244)。所述宿主优选为异源(heterologous)宿主(酶对宿主是外源的)，但在某些情况下所述宿主也可为同源宿主(酶对宿主是天然的)。单组分纤维素分解蛋白质也可通过从发酵液纯化上述蛋白质来制备。

适用于本发明的商业的纤维素分解蛋白制备物的实例包括，例如，CELLIC^TM Ctec(Novozymes A/S)，CELLUCLAST^TM(Novozymes A/S)和NOVOZYM^TM 188(Novozymes A/S)。可以使用的包含纤维素酶的其它商业上可得到的制备物包括CELLUZYME^TM、CEREFLO^TM和ULTRAFLO^TM(Novozymes A/S)，LAMINEX^TM和SPEZYME^TM CP(Genencor Int.)，ROHAMENT^TM 7069W(

GmbH)以及

LDI、

LBR或150L(Dyadic International，Inc.)。所述纤维素酶以固形物的约0.001到约5.0wt.％，更优选固形物的约0.025到约4.0wt.％，且最优选固形物的约0.005到约2.0wt.％的有效量添加。

可以用于本发明的方法的细菌内切葡聚糖酶的实例包括但不限于，解纤维热酸菌(Acidothermus cellulolyticus)内切葡聚糖酶(WO 91/05039；WO93/15186；美国专利5,275,944；WO 96/02551；美国专利5,536,655，WO2000/70031，WO 2005/093050)；Thermobifida fusca内切葡聚糖酶III(WO2005/093050)；和Thermobifida fusca内切葡聚糖酶V(WO 2005/093050)。

可以用于本发明的方法的真菌内切葡聚糖酶的实例包括但不限于，里氏木霉内切葡聚糖酶I(Penttila等，1986，Gene 45：253-263；GENBANK^TM登录号M15665)；里氏木霉内切葡聚糖酶II(Saloheimo等，1988，Gene 63：11-22；GENBANK^TM登录号M19373)；里氏木霉内切葡聚糖酶III(Okada等，1988，Appl.Environ.Microbiol.64：555-563；GENBANK^TM登录号AB003694)；里氏木霉内切葡聚糖酶IV(Saloheimo等，1997，Eur.J.Biochem.249：584-591；GENBANK^TM登录号Y11113)；以及里氏木霉内切葡聚糖酶V(Saloheimo等，1994，Molecular Microbiology 13：219-228；GENBANK^TM登录号Z33381)；棘孢曲霉内切葡聚糖酶(Ooi等，1990，Nucleic Acids Research 18：5884)；川地曲霉(Aspergillus kawachii)内切葡聚糖酶(Sakamoto等，1995，Current Genetics 27：435-439)；胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwinia carotovara)内切葡聚糖酶(Saarilahti等，1990，Gene 90：9-14)；尖镰孢内切葡聚糖酶(GENBANK^TM登录号L29381)；灰腐质霉thermoidea变种内切葡聚糖酶(GENBANK^TM登录号AB003107)；Melanocarpus albomyces内切葡聚糖酶(GENBANK^TM登录号MAL515703)；粗糙脉孢菌内切葡聚糖酶(GENBANK^TM登录号XM_324477)；特异腐质霉内切葡聚糖酶V；嗜热毁丝霉CBS 117.65内切葡聚糖酶；担子菌纲(basidiomycete)CBS 495.95内切葡聚糖酶；担子菌纲CBS 494.95内切葡聚糖酶；土生梭孢霉NRRL 8126CEL6B内切葡聚糖酶；土生梭孢霉NRRL 8126CEL6C内切葡聚糖酶；土生梭孢霉NRRL 8126CEL7C内切葡聚糖酶；土生梭孢霉NRRL 8126CEL7E内切葡聚糖酶；土生梭孢霉NRRL 8126CEL7F内切葡聚糖酶；Cladorrhinum foecundissimum ATCC 62373CEL7A内切葡聚糖酶；以及里氏木霉菌株VTT-D-80133号内切葡聚糖酶(GENBANK^TM登录号M15665)。

可用于本发明的方法的纤维二糖水解酶的示例包括但不限于，里氏木霉纤维二糖水解酶I；里氏木霉纤维二糖水解酶II；特异腐质霉纤维二糖水解酶I、嗜热毁丝霉纤维二糖水解酶II、土生梭孢霉纤维二糖水解酶II(CEL6A)、嗜热毛壳(Chaetomium thermophilum)纤维二糖水解酶I以及嗜热毛壳纤维二糖水解酶II。

可用于本发明的方法的β-葡糖苷酶的实例包括但不限于米曲霉β-葡糖苷酶；烟曲霉β-葡糖苷酶；巴西青霉(Penicillium brasilianum)IBT 20888β-葡糖苷酶；黑曲霉β-葡糖苷酶；以及棘孢曲霉β-葡糖苷酶。

具有β-葡糖苷酶活性的米曲霉多肽可根据WO 2002/095014获得。具有β-葡糖苷酶活性的烟曲霉多肽可根据WO 2005/047499获得。具有β-葡糖苷酶活性的巴西青霉多肽可根据WO 2007/019442获得。具有β-葡糖苷酶活性的黑曲霉多肽可根据Dan等，2000，J.Biol.Chem.275：4973-4980获得。具有β-葡糖苷酶活性的棘孢曲霉多肽可根据Kawaguchi等，1996，Gene 173：287-288获得。

所述β-葡糖苷酶可以是融合蛋白。在一个方面，所述β-葡糖苷酶是根据WO 2008/057637获得的米曲霉β-葡糖苷酶变体BG融合蛋白或米曲霉β-葡糖苷酶融合蛋白。

其它内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶公开于许多使用根据Henrissat B.，1991，A classification of glycosyl hydrolases based on amino-acidsequence similarities，Biochem.J.280：309-316以及Henrissat B.和Bairoch A.，1996，Updating the sequence-based classification of glycosyl  hydrolases，Biochem.J.316：695-696的分类法的糖基水解酶家族中。

其它可用于本发明的纤维素分解酶描述于EP 495,257、EP 531,315、EP531，372、WO 89/09259、WO 94/07998、WO 95/24471、WO 96/11262、WO96/29397、WO 96/034108、WO 97/14804、WO 98/08940、WO 98/012307、WO 98/13465、WO 98/015619、WO 98/015633、WO 98/028411、WO 99/06574、WO 99/10481、WO 99/025846、WO 99/025847、WO 99/031255、WO2000/009707、WO 2002/050245、WO 2002/0076792、WO 2002/101078、WO2003/027306、WO 2003/052054、WO 2003/052055、WO 2003/052056、WO2003/052057、WO 2003/052118、WO 2004/016760、WO 2004/043980、WO2004/048592、WO 2005/001065、WO 2005/028636、WO 2005/093050、WO2005/093073、WO 2006/074005、WO 2006/117432、WO 2007/071818、WO2007/071820、WO 2008/008070、WO 2008/008793、美国专利No.4,435,307、美国专利No.5,457,046、美国专利No.5,648,263、美国专利No.5,686,593、美国专利No.5,691,178、美国专利No.5,763,254以及美国专利No.5,776,757。

在本发明的方法中，可使用任何具有纤维素分解增强活性的多肽。

在第一方面，所述具有纤维素分解增强活性的多肽包含下述基序：[ILMV]-P-X(4，5)-G-X-Y-[ILMV]-X-R-X-[EQ]-X(4)-[HNQ]和[FW]-[TF]-K-[AIV]，

其中X是任何氨基酸，X(4，5)是在4或5个连续位置上的任何氨基酸，而X(4)是在4个连续位置上的任何氨基酸。

具有上述指明基序的多肽可另外还包含：

H-X(1，2)-G-P-X(3)-[YW]-[AILMV]，

[EQ]-X-Y-X(2)-C-X-[EHQN]-[FILV]-X-[ILV]，或

H-X(1，2)-G-P-X(3)-[YW]-[AILMV]和[EQ]-X-Y-X(2)-C-X-[EHQN]-[FILV]-X-[ILV]，

其中X是任何氨基酸，X(1，2)是在1个位置或2个连续位置上的任何氨基酸，X(3)是在3个连续位置上的任何氨基酸，而X(2)是在2个连续位置上的任何氨基酸。在上述基序中，使用公认的IUPAC单字母氨基酸缩写。

在一个优选的方面，具有纤维素分解增强活性的多肽另外还包含H-X(1，2)-G-P-X(3)-[YW]-[AILMV]。在另一优选的方面，具有纤维素分解增强活性的分离的多肽另外还包含[EQ]-X-Y-X(2)-C-X-[EHQN]-[FILV]-X-[ILV]。在另一优选的方面，具有纤维素分解增强活性的多肽另外还包含H-X(1，2)-G-P-X(3)-[YW]-[AILMV]和[EQ]-X-Y-X(2)-C-X-[EHQN]-[FILV]-X-[ILV]。

在第二个方面，具有纤维素分解增强活性的多肽包含下述基序：[ILMV]-P-x(4，5)-G-x-Y-[ILMV]-x-R-x-[EQ]-x(3)-A-[HNQ]，

其中x是任何氨基酸，x(4，5)是在4或5个连续位置上的任何氨基酸，而x(3)是在3个连续位置上的任何氨基酸。在上述基序中，使用公认的IUPAC单字母氨基酸缩写。

可用于本发明方法的具有纤维素分解增强活性的多肽的实例包括但不限于，来自土生梭孢霉的具有纤维素分解增强活性的多肽(WO2005/074647)；来自桔橙嗜热霉(Thermoascus aurantiacus)的具有纤维素分解增强活性的多肽(WO 2005/074656)；和来自里氏木霉的具有纤维素分解增强活性的多肽(WO 2007/089290)。

适用于本发明的商业性木聚糖降解酶制备物的实例包括，例如，SHEARZYME^TM(Novozymes A/S)、CELLIC^TM Htec(Novozymes A/S)、

(Novozymes A/S)、

(Novozymes A/S)、

HC(Novozymes A/S)、

Xylanase(Genencor)、

TX-200A(AB Enzymes)、HSP 6000Xylanase(DSM)、DEPOL^TM333P(Biocatalysts Limit，Wales，UK)、DEPOL^TM740L.(Biocatalysts Limit，Wales，UK)和DEPOL^TM 762P(Biocatalysts Limit，Wales，UK)。

可用于本发明方法的木聚糖酶的实例包括但不限于，棘孢曲霉木聚糖酶(GeneSeqP：AAR63790；WO 94/21785)，烟曲霉木聚糖酶(WO 2006/078256)和土生梭孢霉NRRL 8126木聚糖酶(WO 2009/079210)。

可用于本发明方法的β-木糖苷酶的实例包括但不限于，里氏木霉β-木糖苷酶(UniProtKB/TrEMBL登录号Q92458)，埃默森踝节菌(SwissProt登录号Q8X212)和粗糙脉孢菌(SwissProt登录号Q7SOW4)。

可用于本发明方法的乙酰木聚糖酯酶的实例包括但不限于，红褐肉座菌(Hypocrea jecorina)乙酰木聚糖酯酶(WO 2005/001036)，粗糙脉孢菌乙酰木聚糖酯酶(UniProt登录号q7s259)，土生梭孢霉NRRL 8126乙酰木聚糖酯酶(WO2009/042846)，球毛壳(Chaetomium globosum)乙酰木聚糖酯酶(Uniprot登录号Q2GWX4)，细丽毛壳(Chaetomium gracile)乙酰木聚糖酯酶(GeneSeqP登录号AAB82124)，颖枯壳针孢(Phaeosphaeria nodorum)乙酰木聚糖酯酶(Uniprot登录号Q0UHJ1)和特异腐质霉DSM 1800乙酰木聚糖酯酶(WO 2009/073709)。

可用于本发明方法的阿魏酸酯酶的实例包括但不限于，特异腐质霉DSM1800阿魏酸酯酶(WO 2009/076122)，粗糙脉孢菌阿魏酸酯酶(UniProt登录号Q9HGR3)和费希新萨托菌(Neosartorya fischeri)阿魏酸酯酶(UniProt登录号A1D9T4)。

可用于本发明方法的阿拉伯呋喃糖苷酶的实例包括但不限于，特异腐质霉DSM 1800阿拉伯呋喃糖苷酶(WO 2009/073383)和黑曲霉阿拉伯呋喃糖苷酶(GeneSeqP登录号AAR94170)。

可用于本发明方法的α-葡糖醛酸糖苷酶的实例包括但不限于，棒曲霉(Aspergillus clavatus)α-葡糖醛酸糖苷酶(UniProt登录号alcc12)，里氏木霉α-葡糖醛酸糖苷酶(Uniprot登录号Q99024)，埃默森踝节菌α-葡糖醛酸糖苷酶(UniProt登录号Q8X211)，黑曲霉α-葡糖醛酸糖苷酶(Uniprot登录号Q96WX9)，土曲霉(Aspergillus terreus)α-葡糖醛酸糖苷酶(SwissProt登录号Q0CJP9)，和烟曲霉α-葡糖醛酸糖苷酶(SwissProt登录号Q4WW45)。

用于本发明方法的酶和蛋白质可通过在含合适碳源和氮源和无机盐的营养培养基上，使用本领域已知方法(参见，例如，Bennett，J.W.and LaSure，L.(编)，More Gene Manipulations in Fungi，Academic Press，CA，1991)发酵上述微生物菌株来产生。合适的培养基可从商业供应商获得，或可根据公开的组成来制备(例如，公开于American Type Culture Collection的目录)。适于生长和酶产生的温度范围和其它条件在本领域是已知的(参见，例如，Bailey，J.E.和Ollis，D.F.，Biochemical Engineering Fundamentals，McGraw-Hill BookCompany，NY，1986)。

所述发酵可为任何培养细胞的方法，其导致酶的表达或分离。因此，发酵可理解为包括摇瓶培养，或小或大规模发酵(包括连续发酵、分批发酵、补料分批发酵或固态发酵)，其在实验室或工业发酵罐中在合适的培养基并在允许所述酶表达或分离的条件下进行。由上述方法产生的所得的酶可从发酵培养基回收，并通过常规方法纯化。

发酵从所述经预处理与水解的纤维素材料或含木聚糖材料获得的可发酵的糖可由一种或多种能够将所述糖直接或间接发酵为所需发酵产物的发酵微生物进行发酵。“发酵”或“发酵方法”指任何发酵方法或包含发酵步骤的任何方法。发酵方法亦包括用于可消费醇工业(例如，啤酒与葡萄酒)、乳制品工业(例如，发酵的乳制品)、皮革工业和烟草工业的发酵方法。发酵条件取决于所需发酵产物以及发酵生物，且可由本领域技术人员简单地确定。

在所述发酵步骤中，作为预处理与酶水解步骤的结果自所述纤维素材料或含木聚糖材料释放的糖由发酵生物(如酵母)发酵为产物，例如乙醇。如本文所述，水解(糖化)和发酵可为分别的或同时的。

任何合适的经水解的纤维素材料或含木聚糖材料可在实施本发明时用于所述发酵步骤。所述材料通常基于所期望的发酵产物(即，自发酵获得的物质)，以及所采用的方法而选择，如本领域所公知的。

在本文中术语“发酵培养基”应理解为指在添加发酵微生物之前的培养基，如，由糖化方法产生的培养基，以及用于同时糖化与发酵方法(SSF)的培养基。

“发酵微生物”指任何微生物，包括细菌与真菌生物，其适用于所期望的发酵方法以产生发酵产物。所述发酵生物可为C₆和/或C₅发酵生物，或其组合。C₆与C₅发酵生物均是本领域所公知的。合适的发酵微生物能够将糖，如葡萄糖、木糖、木酮糖、阿拉伯糖、麦芽糖、甘露糖、半乳糖或寡糖直接或间接发酵(即转化)为所期望的发酵产物。

产生乙醇的细菌与真菌发酵生物的实例描述于Lin等，2006，Appl.Microbiol.Biotechnol.69：627-642。

可发酵C6糖的发酵微生物的实例包括细菌与真菌生物，如酵母。优选的酵母包括酵母属菌种(Saccharomyces spp.)，优选酿酒酵母的菌株。

可发酵C5糖的发酵生物的实例包括细菌与真菌生物，如酵母。优选的C5发酵酵母包括毕赤酵母属(Pichia)，优选树干毕赤酵母(Pichia stipitis)的菌株，如树干毕赤酵母CBS 5773；假丝酵母属(Candida)，优选博伊丁氏假丝酵母(Candida boidinii)，芸薹假丝酵母(Candida brassicae)，休哈塔假丝酵母(Candida shehatae)，迪丹氏假丝酵母(Candida diddensii)，假热带假丝酵母(Candida pseudotropicalis)或产朊假丝酵母(Candida utilis)的菌株。

其它发酵生物包括发酵单胞菌属(Zymomonas)，如运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)的菌株；汉逊酵母属，如异常汉逊氏酵母(Hansenulaanomala)的菌株；克鲁维酵母属，如脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fragilis)的菌株；裂殖酵母属，如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)的菌株；以及大肠杆菌，特别是经遗传修饰而改善了乙醇产量(yield)的大肠杆菌菌株。

在一个优选方面，酵母是酵母属菌种。在一个更优选方面，酵母为酿酒酵母。在另一个更优选方面，酵母为糖化酵母(Saccharomyces distaticus)。在另一个更优选方面，酵母为葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum)。在另一个优选方面，酵母为克鲁维酵母属。在另一个更优选方面，酵母为马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)。在另一个更优选方面，酵母为脆壁克鲁维酵母。在另一个优选方面，酵母为假丝酵母属。在另一个更优选方面，酵母为博伊丁氏假丝酵母。在另一个更优选方面，酵母为芸薹假丝酵母。在另一个更优选方面，酵母为迪丹氏假丝酵母。在另一个更优选方面，酵母为假热带假丝酵母。在另一个更优选方面，酵母为产朊假丝酵母。在另一个优选方面，酵母为棍孢属(Clavispora)。在另一个更优选方面，酵母为葡萄牙棍孢(Clavispora lusitaniae)。在另一个更优选方面，酵母为仙人掌棍孢(Clavispora opuntiae)。在另一个优选方面，酵母属于管囊酵母属(Pachysolen)。在另一个更优选方面，酵母为嗜鞣管囊酵母(Pachysolen tannophilus)。在另一个优选方面，酵母属于毕赤酵母属。在另一个更优选方面，酵母为树干毕赤酵母。在另一个优选方面，酵母属于酒香酵母属(Bretannomyces)。在另一个更优选方面，酵母为克劳森酒香酵母(Bretannomyces clausenii)(Philippidis，G.P.，1996，Cellulose bioconversiontechnology，于Handbook on Bioethanol：Production and Utilization，Wyman，C.E.编，Taylor&Francis，Washington，DC，179-212)。

可有效将己糖与戊糖发酵为乙醇的细菌包括，例如，运动发酵单胞菌与热纤维梭菌(Clostridium thermocellum)(Philippidis，1996，见上)。

在一个优选方面，所述细菌为发酵单胞菌属。在一个更优选方面，所述细菌为运动发酵单胞菌。在另一个优选方面，所述细菌为梭菌属(Clostridium)。在另一个更优选方面，所述细菌为热纤维梭菌。

适用于乙醇产生的商业上可得到的酵母包括，例如，ETHANOL RED^TM酵母(可得自Fermentis/Lesaffre，USA)，FALI^TM(可得自Fleischmann’s Yeast，USA)，SUPERSTART^TM与THERMOSACC^TM新鲜酵母(可得自EthanolTechnology，WI，USA)，BIOFERM^TM AFT与XR(可得自NABC-NorthAmerican Bioproducts Corporation，GA，USA)，GERT STRAND^TM(可得自GertStrand AB，Sweden)，以及FERMIOL^TM(可得自DSM Specialties)。

在一个优选的方面，所述发酵微生物经遗传修饰以提供发酵戊糖的能力，例如利用木糖，利用阿拉伯糖以及共同利用木糖与阿拉伯糖的微生物。

将异源基因克隆入多种发酵微生物导致能够将己糖与戊糖转化为乙醇(共发酵)的生物的构建(Chen和Ho，1993，Cloning and improving the expression ofPichia stipitis xylose reductase gene in Saccharomyces cerevisiae，Appl.Biochem.Biotechnol.39-40：135-147；Ho等，1998，Genetically engineered Saccharomycesyeast capable of effectively cofermenting glucose and xylose，Appl.Environ.Microbiol.64：1852-1859；Kotter和Ciriacy，1993，Xylose fermentation bySaccharomyces cerevisiae，Appl.Microbiol.Biotechnol.38：776-783；Walfridsson等，1995，Xylose-metabolizing Saccharomyces cerevisiae strains overexpressing theTKL 1and TAL1 genes encoding the pentose phosphate pathway enzymestransketolase and transaldolase，Appl.Environ.Microbiol.61：4184-4190；Kuyper等，2004，Minimal metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae for efficientanaerobic xylose fermentation：a proof of principle，FEMS Yeast Research 4：655-664；Beall等，1991，Parametric studies of ethanol production from xylose andother sugars by recombinant Escherichia coli，Biotech.Bioeng.38：296-303；Ingram等，1998，Metabolic engineering of bacteria for ethanol production，Biotechnol.Bioeng.58：204-214；Zhang等，1995，Metabolic engineering of a pentose metabolismpathway in ethanologenic Zymomonas mobilis，Science 267：240-243；Deanda等，1996，Development of an arabinose-fermenting Zymomonas mobilis strain bymetabolic pathway engineering，Appl.Environ.Microbiol.62：4465-4470；WO2003/062430，木糖异构酶)。

在一个优选方面，所述经遗传修饰的发酵微生物为酿酒酵母。在另一个优选方面，所述经遗传修饰的发酵微生物为运动发酵单胞菌。在另一个优选方面，所述经遗传修饰的发酵微生物为大肠杆菌。在另一个优选方面，所述经遗传修饰的发酵微生物为产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)。在另一个优选方面，所述经遗传修饰的发酵微生物为克鲁维酵母属菌种(Kluyveromyces sp.)。

本领域众所周知的是上述生物亦可用于产生其它物质，如本文所述。

所述发酵微生物通常添加至经降解的木素纤维素或其水解物，且将所述发酵进行约8到约96小时，例如约24到约60小时。温度通常为约26℃到约60℃，特别是约32℃或50℃，且在约pH3到约pH8，如约pH4-5、6或7。

在一个优选方面，将所述酵母和/或另一微生物施用于经降解的纤维素材料或含木聚糖材料，且所述发酵进行约12到约96小时，例如通常24-60小时。在一个优选方面，温度优选为约20℃-约60℃，更优选约25℃到约50℃，且最优选约32℃到约50℃，特别是约32℃或50℃，且pH通常为约pH3-约pH7，优选约pH4-7。然而，一些发酵生物，例如细菌具有较高的最适发酵温度。酵母或其它微生物优选以每ml发酵液约10⁵到10¹²，优选约10⁷到10¹⁰，特别是约2x 10⁸活细胞计数的量施用。关于使用酵母以供发酵的进一步指导可见于，例如，“The Alcohol Textbook”(K.Jacques，T.P.Lyons和D.R.Kelsall编，Nottingham University Press，United Kingdom 1999)，其通过提述并入本文。

对于乙醇产生，在发酵之后，蒸馏经发酵的浆料以提取乙醇。根据本发明的方法获得的乙醇可用作，例如，燃料乙醇，饮用乙醇(即，可饮用的中性酒精)，或工业乙醇。

发酵刺激剂(fermentation stimulator)可与本文所述的任何方法组合以进一步改善所述发酵方法，以及特别是所述发酵微生物的性能，例如，速率增加与乙醇产量。“发酵刺激剂”指针对发酵微生物(特别是，酵母)的生长的刺激剂。优选的对于生长的发酵刺激剂包括维生素与矿物质。维生素的实例包括多种维生素、生物素、泛酸(盐)、烟酸、内消旋肌醇、硫胺素、吡哆醇、对氨基苯甲酸、叶酸、核黄素和维生素A、B、C、D及E。参见，例如，Alfenore等，Improvingethanol production and viability of Saccharomyces cerevisiae by a vitamin feedingstrategy during fed-batch process，Springer-Verlag(2002)，其通过提述并入本文。矿物质的实例包括矿物质与矿物质盐，其可供应包含P、K、Mg、S、Ca、Fe、Zn、Mn和Cu的营养物。

发酵产物：发酵产物可为源自发酵的任何物质。发酵产物可为，但不限于醇(例如，阿拉伯糖醇、丁醇、乙醇、甘油、甲醇、1，3-丙二醇、山梨醇与木糖醇)；有机酸(例如，乙酸、醋酮酸、己二酸、抗坏血酸、柠檬酸、2，5-二酮-D-葡糖酸、甲酸、富马酸、葡萄糖二酸、葡糖酸、葡糖醛酸、戊二酸、3-羟基丙酸、衣康酸、乳酸、苹果酸、丙二酸、草酸、丙酸、琥珀酸与木质酸)；酮(例如，丙酮)；氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、赖氨酸、丝氨酸和苏氨酸)；以及气体(例如，甲烷、氢气(H₂)、二氧化碳(CO₂)和一氧化碳(CO))。所述发酵产物亦可为作为高价值产物的蛋白质。

在一个优选方面，发酵产物为醇。应理解术语“醇”涵盖包含一个或多个羟基部分(moiety)的物质。在一个更优选方面，醇为阿拉伯糖醇。在另一个更优选方面，醇为丁醇。在另一个更优选方面，醇为乙醇。在另一个更优选方面，醇为甘油。在另一个更优选方面，醇为甲醇，在另一个更优选方面，醇为1，3-丙二醇。在另一个更优选方面，醇为山梨醇。在另一个更优选方面，醇为木糖醇。参见，例如Gong，C.S.，Cao，N.J.，Du，J.和Tsao，G.T.，1999，Ethanol production from renewable resources，于Advances in BiochemicalEngineering/Biotechnology，Scheper，T.编，Springer-Verlag Berlin Heidelberg，Germany，65：207-241；Silveira，M.M.和Jonas，R.，2002，The biotechnologicalproduction of sorbitol，Appl.Microbiol.Biotechnol.59：400-408；Nigam，P.和Singh，D.，1995，Processes for fermentative production of xylitol-a sugarsubstitute，Process Biochemistry 30(2)：117-124；Ezeji，T.C.，Qureshi，N.和Blaschek，H.P.，2003，Production of acetone，butanol and ethanol by Clostridiumbeijerinckii BA101and in situ recovery by gas stripping，World Journal ofMicrobiology and Biotechnology 19(6)：595-603。

在另一个优选方面，发酵产物为有机酸。在另一个更优选方面，有机酸为乙酸。在另一个更优选方面，有机酸为醋酮酸。在另一个更优选方面，有机酸为己二酸。在另一个更优选方面，有机酸为抗坏血酸。在另一个更优选方面，有机酸为柠檬酸。在另一个更优选方面，有机酸为2，5-二酮-D-葡糖酸。在另一个更优选方面，有机酸为甲酸。在另一个更优选方面，有机酸为富马酸。在另一个更优选方面，有机酸为葡萄糖二酸。在另一个更优选方面，有机酸为葡糖酸。在另一个更优选方面，有机酸为葡糖醛酸。在另一个更优选方面，有机酸为戊二酸。在另一个更优选方面，有机酸为3-羟基丙酸。在另一个更优选方面，有机酸为衣康酸。在另一个更优选方面，有机酸为乳酸。在另一个更优选方面，有机酸为苹果酸。在另一个更优选方面，有机酸为丙二酸。在另一个更优选方面，有机酸为草酸。在另一个更优选方面，有机酸为丙酸。在另一个更优选方面，有机酸为琥珀酸。在另一个更优选方面，有机酸为木糖酸。参见，例如，Chen，R.和Lee，Y.Y.，1997，Membrane-mediated extractive fermentation for lacticacid production from cellulosic biomass，Appl.Biochem.Biotechnol.63-65：435-448。

在另一个优选方面，发酵产物为酮。应理解术语“酮”涵盖含有一个或多个酮部分的物质。在另一个更优选方面，酮为丙酮。参见，例如，Qureshi和Blaschek，2003，见上。

在另一个优选方面，发酵产物为氨基酸。在另一个更优选方面，氨基酸为天冬氨酸。在另一个更优选方面，氨基酸为谷氨酸。在另一个更优选方面，氨基酸为甘氨酸。在另一个更优选方面，氨基酸为赖氨酸。在另一个更优选方面，氨基酸为丝氨酸。在另一个更优选方面，氨基酸为苏氨酸。参见，例如，Richard，A.和Margaritis，A.，2004，Empirical modeling of batch fermentationkinetics for poly(glutamic acid)production and other microbial biopolymers，Biotechnology and Bioengineering 87(4)：501-515。

在另一个优选方面，发酵产物为气体。在另一个更优选方面，气体为甲烷。在另一个更优选方面，气体为H₂。在另一个更优选方面，气体为CO₂。在另一个更优选方面，气体为CO。参见，例如，Kataoka，N.，A.Miya和K.Kiriyama，1997，Studies on hydrogen production by continuous culture system of hydrogen-producinganaerobic bacteria，Water Science and Technology36(6-7)：41-47；和Gunaseelan V.N.于Biomass and Bioenergy，Vol.13(1-2)，pp.83-114，1997，Anaerobic digestion ofbiomass for methane production：A review。

回收发酵产物可任选地自发酵培养基使用任何本领域已知方法加以回收，所述方法包括但不限于层析、电泳方法、差示溶解度、蒸馏或提取。例如，醇自经发酵的纤维素材料或含木聚糖材料分离并通过常规蒸馏方法纯化。可获得纯度高至约96vol.％的乙醇，其可用作，例如燃料乙醇、饮用乙醇(即，可饮用的中性酒精)或工业乙醇。

其它用途

本发明的多肽还可与有限活性的其它木聚糖分解酶一同使用以降解木聚糖，以供产生寡糖。所述寡糖可用作填充剂(bulking agent)，如从谷类(cereal)细胞壁材料释放的阿拉伯木聚糖寡糖，或多少纯化的来自谷类的阿拉伯木聚糖。

本发明的多肽还可与其它木聚糖分解酶组合使用以将木聚糖降解为木糖和其它单糖(美国专利5,658,765号)。可将释放出的木糖转化为其它化合物。

本发明的多肽可与其它酶如葡聚糖酶一同使用以改善从富油植物材料中提取油，如从玉米胚(com-embryo)中提取玉米油。

本发明的多肽还可用于烘烤以改善生面团的发面(development)、弹性和/或稳定性，和/或烘烤产物的体积、碎屑结构(crumb structure)和/或防腐性(参见美国专利5,693,618号)。所述多肽还可用于制备从任何类型的面粉或粗粉(meal)(例如，基于小麦、黑麦、大麦、燕麦或玉米)制备的烘烤产物或生面团。以本发明的多肽产生的烘烤产物包括面包、面包卷(rolls)、长棍面包(baquettes)等。就烘烤而言，本发明的多肽可用作仅有的或主要的酶活性，或可与其它酶如木聚糖酶、脂肪酶、淀粉酶、氧化酶(例如葡萄糖氧化酶，过氧化物酶)、漆酶和/或蛋白酶组合使用。

本发明的多肽还可用于修饰动物饲料，并可在体外(通过修饰饲料的组分)或体内发挥其作用以改善饲料的可消化性，并增加其利用效率(美国专利6,245,546号)。所述多肽可添加至含大量阿拉伯木聚糖和葡糖醛酸木聚糖的动物饲料组合物，例如，含谷物(如大麦、小麦、黑麦、燕麦或玉米)的饲料。当添加至饲料时，所述多肽将改善植物细胞壁材料的体内分解，这部分是由于肠粘度的减少(Bedford等，1993，Proceedings of the 1st Symposium onEnzymes in Animal Nutrition，pp.73-77)，从而实现了动物对植物营养物利用的改善。由此，改善了所述动物的生长速率和/或饲料转化比(即，摄入饲料的重量相对于重量增加)。

本发明的多肽还可用于造纸和纸浆工业，其中包括(inter alia)在漂白工艺中增强漂白纸浆的亮度，由此减少用于漂白阶段的氯的量(Eriksson，1990，Wood Science and Technology 24：79-101；Paice等，1988，Biotechnol.and Bioeng.32：235-239，以及Pommier等，1989，Tappi Journal 187-191)。对木素纤维素纸浆的处理可，例如，如美国专利5,658,765号，WO 93/08275，WO 91/02839和WO 92/03608所述进行。一般而言，在制备纸产物中，通常用木聚糖酶处理Kraft浆以去除木素。由于木聚糖的高乙酰化程度，当在木聚糖酶处理之前或同时用乙酰木聚糖酯酶处理纸浆时，木聚糖酶的效力大为增加。

本发明的多肽还可用于啤酒酿造，特别是改善含有例如大麦和/或高粱麦芽的麦芽汁的可滤过性(filterability)(WO 2002/24926)。所述多肽可以以与常规用于酿造的戊聚糖酶(pentosanase)相同的方式使用，例如，如

等，1993，J.Inst.Brew.99：243-248和EP 227159所述。此外，所述多肽可用于处理酿酒酒糟(brewers spent grain)，即来自啤酒麦芽汁生产的残余物，其包含大麦或发芽的大麦或其它谷物，从而改善所述残余物用于例如动物饲料的利用。

本发明的可用于分离植物细胞材料的组分，特别是谷物组分如小麦组分。特别感兴趣的是将小麦分离为谷蛋白和淀粉，即具有可观的商业利益的组分。分离过程可通过使用本领域已知方法来进行，如作为水力旋流器(hydroclone)或倾析器(decanter)工艺进行的所谓打糊(batter)工艺(或湿磨工艺)。在所述打糊工艺中，起始材料是所述植物材料的稀释的可泵送的分散物，如要进行分离的小麦。在小麦分离工艺中，所述分散物通常由小麦粉和水制备。

本发明的多肽还可用于制备果汁或蔬菜汁以增加产量。

本发明的多肽还可用作纺织品酶法煮炼(enzymatic scouring)系统的组分。

本发明的多肽还可与其它酶功能组合用于洗衣洗涤剂应用。

信号肽

本发明还涉及编码信号肽的分离的多核苷酸，所述信号肽包含SEQ IDNO：2的氨基酸1至17，或者由SEQ ID NO：2的氨基酸1至17组成。

在一个优选的方面，编码信号肽的分离的多核苷酸包含SEQ ID NO：1的核苷酸1至51，或者由SEQ ID NO：1的核苷酸1至51组成。

本发明还涉及核酸构建体，所述核酸构建体包含编码蛋白质的基因，其中所述基因与所述编码信号肽的分离的多核苷酸可操作地连接，其中所述基因对于所述编码信号肽的多核苷酸是外源的。

本发明还涉及包含这样的核苷酸构建体的重组表达载体和重组宿主细胞。

本发明还涉及产生蛋白质的方法，包括(a)在有助于产生蛋白质的条件下培养重组宿主细胞，所述宿主细胞包含编码所述蛋白质的基因，其可操作地连接于上述编码信号肽的多核苷酸；和(b)回收所述蛋白质。

所述蛋白质对于宿主细胞可以是天然的或异源的。术语“蛋白质”在本文的意思不是指特定长度的编码产物，并因此涵盖肽、寡肽和蛋白质。术语“蛋白质”还涵盖组合以形成编码产物的两种或更多种多肽。所述蛋白质还包括杂合多肽，其包含从至少两种不同的蛋白质获得的部分或完全多肽序列的组合，其中一个或多个(几个)对于宿主细胞可以是异源或天然的。蛋白质进一步包括上述蛋白质和杂合蛋白质天然存在的等位基因变异和工程化变异。

蛋白质优选是激素或其变体、酶、受体或其部分、抗体或其部分，或报告蛋白(reporter)。在一个更优选的方面，所述蛋白质是氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂合酶(lyase)、异构酶或连接酶。在一个更加优选的方面，所述蛋白质是氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、转化酶、漆酶、另外的脂肪酶、甘露糖苷酶、变聚糖酶(mutanase)、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、肌醇六磷酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶或木聚糖酶。

基因可以获得自任何原核、真核或其它来源。

通过以下实施例进一步描述本发明，但不应将其理解为对本发明范围的限制。

实施例

材料

用作缓冲液和底物的化学品是至少试剂级的商业产品。

菌株

将嗜热毁丝霉CBS 117.65用作编码具有乙酰木聚糖酯酶活性的多肽的家族CE5基因的来源。

培养基

YEG培养基由每升20g右旋糖和5g酵母提取物组成。

YP培养基由每升10g酵母提取物和20g细菌蛋白胨组成。

COVEA尿素-乙酰胺+板由每升20ml COVEA盐溶液，220g山梨醇，10g葡萄糖，10ml 1M乙酰胺和30g细菌琼脂糖组成；用氢氧化钠将pH调至5.2。

COVE A盐溶液由每升26g KCl，26g MgSO₄，76g KH₂PO₄，和50mlCOVE A痕量元素溶液组成。

COVEA痕量元素溶液由每升0.04g Na₂B₄O₇·10H₂O，0.4g CuSO₄·5H₂O，0.8g FeSO₄·7H₂O，0.8gMnSO₄·2H₂O，0.8g Na₂MoO₄·2H₂O，10gZnSO₄·7H₂O，和10g柠檬酸组成。

实施例1：嗜热毁丝霉CBS 117.65基因组DNA提取

将嗜热毁丝霉CBS 117.65菌株在带挡板的摇瓶中的100ml YEG培养基中在45℃和200rpm生长2日。通过使用

(Calbiochem，La Jolla，CA，USA)过滤来收获菌丝体，在去离子水中洗涤两次，并在液氮中冻结。将冻结的菌丝体用杵和研钵磨碎至细粉，并使用

Plant Maxi Kit(QIAGEN Inc.，Valencia，CA，USA)分离总DNA。

实施例2：从嗜热毁丝霉CBS 117.65分离家族CE5乙酰木聚糖酯酶的部分片段

使用共有-简并杂合寡核苷酸引物程序(Consensus-degenerate hybridoligonucleotide primer program)(CODEHOP；Rose等，1998，Nucleic AcidsResearch26：1628-1635)，针对多种乙酰木聚糖酯酶的同源性的区域设计简并引物。用于生成嗜热毁丝霉乙酰木聚糖酯酶基因片段的简并引物如下所示：

引物MyctAXEFnterm6

5’-CCCGGCCATCCACGTNTTYGGNG-3’(SEQ ID NO：3)

简并引物MyctAXEFnterm6的蛋白质翻译：

PAIHVFG

引物MyctAXER8：

5′-CCATGATCTGGCCGCCYTGNSWRTA-3’(SEQ ID NO：4)

简并引物MyctAXER8的蛋白质翻译：

YSQGGQIMD

为了获得嗜热毁丝霉乙酰木聚糖酯酶基因的起始DNA片段，在6个43℃至63.6℃范围的不同退火温度进行梯度PCR。扩增反应物(25μl)由112ng作为模板的嗜热毁丝霉CBS 117.65基因组DNA，各0.4mM的dATP、dTTP、dGTP和dCTP，各50pmol的引物MyctAXEFnterm6和引物MyctAXER8，1X

GC-Melt LA Buffer(Clontech Laboratories，Inc.，MountainView，CA，USA)和1.25单位的

GC Genomic Polymerase Mix(Clontech Laboratories，Inc.，Mountain View，CA，USA)组成。扩增使用

5333(Eppendorf Scientific，Inc.，Westbury，NY，USA)进行，其程序为：95℃预变性1分钟；30个循环，每个循环在变性温度95℃30秒；在退火温度53℃+/-10℃30秒(6个梯度选项)和在70℃延伸1分钟；且在70℃最终延伸10分钟。

通过使用TBE缓冲液(每升10.8gTris碱，5.5g硼酸和4ml 0.5M EDTApH 8.0)的1.0％琼脂糖凝胶电泳来分离反应产物。将来自63.6℃变性温度的大约400bp的PCR产物条带从凝胶切出，使用

Gel ExtractionKit(QIAGEN Inc.，Valencia，CA，USA)根据制造商的说明进行纯化，并测序。PCR片段的测序是用Perkin-Elmer Applied Biosystems Model 377XLAutomated DNA Sequencer(Perkin-Elmer/Applied Biosystems，Inc.，Foster City，CA，USA)使用染料终止子化学(Giesecke等，1992，Journal of Virology Methods38：47-60)和引物步移策略进行的。获得了部分片段，其编码包含与其他已知的乙酰木聚糖酯酶的同源性的肽片段。

实施例3：分离全长嗜热毁丝霉CBS 117.65AXE1乙酰木聚糖酯酶基因

从嗜热毁丝霉CBS 117.65使用GENOMEWALKER^TM Universal Kit(Clontech Laboratories，Inc.，Mountain View，CA，USA)根据制造商的说明分离了全长的家族CE5乙酰木聚糖酯酶基因。将来自嗜热毁丝霉CBS 117.65的总基因组DNA分别用产生平端的四种不同限制性酶(Dra I、Eco RV、Pvu II和Stu I)消化。然后将每批经消化的基因组DNA分别连接于GENOMEWALKER^TM Adaptor(Clontech Laboratories，Inc.，Mountain View，CA，USA)以构建四个文库。然后将这四个文库在使用四个如下所示的基因特异性引物的PCR反应中用作模板，其中两个是用于初级和次级PCR扩增直至编码所述乙酰木聚糖酯酶的N端的5’端的片段的上游，而两个是用于初级和次级PCR扩增直至编码所述乙酰木聚糖酯酶的C端的3’端的片段的下游。下述引物是基于如实施例2所述获得的来自嗜热毁丝霉的部分家族CE5乙酰木聚糖酯酶基因序列而设计的。

N-端：

引物MyctAXEntermGWGSP1_2(初级)：

5′-AAGCTCGTCACAGCGGAGACAACCGCCT-3′(SEQ ID NO：5)

引物MyctAXEGSP25’R(次级)：

5′-GGTACGCCTGCACGACCATGTTGACGA-3′(SEQ ID NO：6)

C-端：

引物MyctAXEGSP13’F(初级)：

5′-TGACCCCGAAAATGCCGCTGACTGTAAA-3′(SEQ ID NO：7)

引物MyctAXEGSP23’F(次级)：

5′-GCGGTTGTCTCCGCTGTGACGAGCTTTA-3′(SEQ ID NO：8)

初级扩增物由1μl(大约6ng)的作为模板的各文库，各0.4mM的dATP、dTTP、dGTP和dCTP，10pmol Adaptor Primer 1(Clontech Laboratories，Inc.，Mountain View，CA，USA)，50pmol引物MyctAXEntermGWGSP1_2或引物MyctAXEGSP13’F，1X

GC-Melt LA Buffer和1.25单位的

GC Genomic Polymerase Mix组成，终体积为25μl。扩增使用

5333进行，其程序为95℃预变性1分钟；7个循环，每个循环在变性温度95℃25秒；在72℃退火并延伸5分钟；32个循环，每个循环在变性温度95℃25秒，在67℃退火并延伸5分钟；且在67℃最终延伸7分钟。

次级扩增物由各1μl的作为模板的初级PCR产物，各0.4mM的dATP、dTTP、dGTP和dCTP，10pmol Adaptor Primer 2(Clontech Laboratories，Inc.，Mountain View，CA，USA)，50pmol引物MyctAXEGSP25’R或引物MyctAXEGSP23’F，1X

GC-Melt LA Buffer和1.25单位的

GC Genomic Polymerase Mix组成，终体积为25μl。扩增使用

5333进行，其程序为95℃预变性1分钟；5个循环，每个循环在变性温度95℃25秒；在72℃退火并延伸5分钟；20个循环，每个循环在变性温度95℃25秒，在67℃退火并延伸5分钟；且在67℃最终延伸7分钟。

将反应产物通过使用TBE缓冲液的1.0％琼脂糖凝胶电泳进行分离。从5’端PCR扩增，分析了两个产物条带：来自Dra I文库的400bp产物条带，来自Pvu II文库的1.8kb产物条带。将两个产物条带从凝胶切出，使用

Gel Extraction Kit纯化，并使用

TA Cloning Kit(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)克隆入

2.1-

载体(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)。使用

9600(QIAGEN Inc.，Valencia，CA，USA)分离质粒DNA。从3’端PCR扩增，分析了两个产物条带：来自Dra I文库的300bp产物条带，和来自Stu I文库的1.2kb产物条带。将两个产物条带从凝胶切出，使用

Gel Extraction Kit纯化，并使用

TACLONING Kit克隆入

2.1-载体。使用

9600分离质粒DNA。如实施例4所述中对质粒DNA进行测序。

实施例4：克隆嗜热毁丝霉乙酰木聚糖酯酶基因和构建黑曲霉表达载体

实施例3中所述的质粒的DNA测序是用Perkin-Elmer AppliedBiosystems Model 377XL Automated DNA Sequencer使用染料终止子化学(Giesecke等，见上)和引物步移策略进行的。

仔细检查核苷酸序列数据的质量，并将所有的序列在PHRED/PHRAP软件(University of Washington，Seattle，WA，USA)的协助下相互比较。将PCR片段序列结果与如实施例2中所述获得的来自嗜热毁丝霉CBS 117.65的部分家族CE5乙酰木聚糖酯酶基因进行比较和比对。

基于其编码的蛋白与已知的乙酰木聚糖酯酶同源物的相似性，构建了嗜热毁丝霉CBS 117.65乙酰木聚糖酯酶序列的基因模型。设计了如下所示的两个合成寡核苷酸引物以从实施例1中制备的基因组DNA PCR扩增嗜热毁丝霉CBS 117.65乙酰木聚糖酯酶基因。

ThihiAXEntermNCO：

5′-ACACAACTGGC-3′(SEQ ID NO：9)

ThihiAXEctermPacl：

5′-CAGTCACCTCTAGTTA

-3′(SEQ ID NO：10)

粗体字母代表编码序列。剩余的序列与pBM120a(WO 2006/078256)的插入位点同源，用于克隆入该质粒以供在黑曲霉MBin120中表达嗜热毁丝霉CBS 117.65AXE1乙酰木聚糖酯酶基因(WO 2004/090155)。

将五十皮摩尔的上述每种引物用于下述PCR反应，其由56ng实施例1中制备的嗜热毁丝霉CBS117.65基因组DNA，1X

2PCR Buffer(Clontech Laboratories，Inc.，Mountain View，CA，USA)，各0.4mM的dATP、dTTP、dGTP和dCTP，以及1X

2Polymerase Mix (ClontechLaboratories，Inc.，Mountain View，CA，USA)组成，最终体积为50μl。扩增使用

5333进行，其程序为1个循环的95℃1分钟，30个循环，每个循环在95℃30秒，60℃30秒，和72℃1分30秒；和在72℃最终延伸7分钟。然后加热块进行4℃的浸泡循环(soak cycle)。

通过使用TBE缓冲液的1.0％琼脂糖凝胶电泳来分离反应产物，其中将大约900bp的产物条带从凝胶切出，并使用

Gel Extraction Kit纯化。

使用

TA CLONING Kit将纯化的900bp凝胶片段克隆入

2.1-

载体(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)，以生成pThihe 117AXE1(图2)。通过如实施例2中所述的DNA测序来确证pThihe117AXE1中的嗜热毁丝霉AXE1插入物。大肠杆菌pThihe117AXE1于2008年7月24日作为大肠杆菌NRRL B-50156保藏在农业研究机构专利培养物保藏中心(AgriculturalResearch Service Patent Culture Collection)，北区研究中心(Northern RegionalResearch Center)，Peoria，IL，USA，保藏日期为2008年7月24日。

用Nco I和Pac I消化质粒pBM120a，通过在TBE缓冲液中的1.0％琼脂糖凝胶电泳来分离，并使用

Gel Extraction Kit根据制造商的说明来纯化。

使用IN-FUSION^TM Cloning Kit将所述900bp基因片段和经消化的载体连接在一起，得到pMMar11(图3)，其中乙酰木聚糖酯酶基因的转录是在来自黑曲霉中性α-淀粉酶和米曲霉丙糖磷酸异构酶的基因的启动子杂合体(NA2-tpi启动子)的调控之下。连接反应液(20μl)由1X IN-FUSION^TM Buffer(BD Biosciences，Palo Alto，CA，USA)，1X B SA(BD Biosciences，Palo Alto，CA，USA)，1μlIN-FUSION^TM酶(1∶10稀释)(BD Biosciences，Palo Alto，CA，USA)，用Nco I和Pac I消化的112ng pBM120a，以及108ng纯化的900bp嗜热毁丝霉PCR产物组成。将反应液在室温温育30分钟。将两μl反应液用于根据制造商的说明转化大肠杆菌XL10

Gold Supercompetent细胞(Stratagene，LaJolla，CA，USA)。挑取大肠杆菌转化子，并使用

9600制备质粒DNA。在pMMar11中的嗜热毁丝霉乙酰木聚糖酯酶基因插入物是通过用Perkin-Elmer Applied Biosystems Model 377XL Automated DNA Sequencer使用染料终止子化学(Giesecke等，1992，见上)和引物步移策略的DNA测序来确证的。使用下面显示的引物064439、064440和064441进行测序。

064439Thehi601R：

5′-AGCTTAGGGTTGGGGTTGTCTCAGG-3′(SEQ ID NO：11)

064440ThihemidF：

5′-CGAAAATGCCGCTGACTGTAAATCA-3′(SEQ ID NO：12)

064441ThihemidR：

5’-AAAGCGCCGAGTTACTCGTTAGGAACA-3’(SEQ ID NO：13)

将包含pMMar11的克隆挑入2x 50ml补充了每ml 100μg氨苄青霉素的LB培养基，并在250ml玻璃烧瓶中以200rpm振荡在37℃生长过夜。使用Plasmid Midi Kit(QIAGEN Inc.，Valencia，CA，USA)根据制造商的说明分离质粒pMMar11。用Pme I消化质粒pMMar11，并使用TBE缓冲液通过1.0％琼脂糖凝胶电泳分离。使用

Gel Extraction Kit根据制造商的说明纯化包含乙酰木聚糖酯酶基因的片段以准备转化黑曲霉MBin120原生质体。

实施例5：表征编码乙酰木聚糖酯酶的嗜热毁丝霉CBS 117.65基因组序列

编码CE5乙酰木聚糖酯酶(AXE1)的嗜热毁丝霉CBS117.65基因组序列的核苷酸序列(SEQ ID NO：1)和推导的氨基酸序列示于图1。基因组片段编码228个氨基酸的多肽。编码序列由三个从起始密码子计67bp(122-188bp)、77bp(314-390bp)和57bp(649-705bp)的内含子所中断。全长编码序列和成熟编码序列的％G+C含量均为57％。使用SignalP软件程序(Nielsen等，1997，Protein Engineering 10：1-6)，预测了17个残基的信号肽。预测的成熟蛋白质包含211个氨基酸，具有22.0kDa的分子量。

氨基酸序列的比较配对全局比对(comparative pairwise global alignment)是使用如EMBOSS的Needle程序执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970，见上)及缺口开放罚分(gap open penalty)为10，而缺口延伸罚分为0.5，和EBLOSUM62矩阵确定的。所述比对显示嗜热毁丝霉CBS117.65AXE1乙酰木聚糖酯酶基因的成熟多肽的推导的氨基酸序列与粗糙脉孢菌乙酰木聚糖酯酶的推导的氨基酸序列(UniProt登录号q7s259)共有72％的同一性。

实施例6：在黑曲霉MBin120中转化并表达嗜热毁丝霉家族CE5乙酰木聚糖酯酶基因

嗜热毁丝霉家族CE5乙酰木聚糖酯酶基因在黑曲霉MBin120中表达。黑曲霉MBin120原生质体是根据Christensen等，1988，Bio/Technology 6：1419-1422的方法制备的。使用大约1μg经Pme I消化的pMMar11来转化黑曲霉MBin120。

用经Pme I消化的pMMar11转化黑曲霉MBin120得到大约50个转化子。将二十个转化子分离至单独的COVEA尿素-乙酰胺+板，并在34℃生长至汇合。从20个转化子的板切出两个3mm见方的琼脂块，并分别接种至125ml塑料摇瓶中的25ml含2％葡萄糖的YP培养基，并以250rpm振荡在34℃温育。在温育3日后，在具有CRITERION^TM Cell(Bio-Rad Laboratories，Inc.，Hercules，CA，USA)CRITERION^TM 8-16％Tris-HCl SDS-PAGE凝胶上，根据制造商的说明，分析了来自每个培养物的7.5μl上清。所得的凝胶用BIO-SAFE^TM CoomassieStain (Bio-Rad Laboratories，Inc.，Hercules，CA，USA)染色。所述培养物的SDS-PAGE图谱(profile)显示所有20个转化子都具有大约21kDa的条带。

将一个高度表达的转化子，黑曲霉MMar210，冻结和生长以供提纯。将黑曲霉MMar210在34℃生长于COVE A尿素-乙酰胺+板上至汇合。切出五个3mm见方的块并接种入2.8升烧瓶中的500ml含2％葡萄糖的YP培养基，和500ml玻璃摇瓶中的100ml含2％葡萄糖的YP培养基，并在34℃以250rpm振荡生长，并在4日后收获。将全培养液以3000xg离心以去除生物质。将来自2.8升烧瓶的上清合并，并单独将来自500ml烧瓶的上清合并，并将两者均使用

Plus 0.22微米过滤器(Millipore，Bedford，MA，USA)灭菌过滤。

实施例7：嗜热毁丝霉乙酰木聚糖酯酶的酶活性测定法

将重组表达的嗜热毁丝霉乙酰木聚糖酯酶的摇瓶培养液(实施例6)首先使用BIO-6Chromatography Columns(Bio-Rad Laboratories，Inc.，Hercules，CA，USA)脱盐。然后对所述材料用乙酸对硝基苯酯(pNP-乙酸酯)底物测定酶活性。

乙酰木聚糖酯酶活性是使用乙酸对硝基苯酯(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO，USA)作为底物在96孔

微滴定板(Corning Inc.，Corning，NY，USA)中确定的。乙酸对硝基苯酯储液是通过将乙酸对硝基苯酯溶解于二甲亚砜(DMSO)以构成100mM溶液来制备的。在测定之前，将储液的样品在含0.01％TWEEN^TM 20的50mM乙酸钠pH 5.0中稀释100倍以制备1mM溶液。将100μl体积的1mM乙酸对硝基苯酯与100μl体积的酶的每个稀释液混合，然后在25℃温育10分钟。运行单独底物，单独酶和单独缓冲液作为对照。0.25、0.2、0.1、0.05和0.02mM的对硝基苯酚标准溶液是通过将10mM储液稀释于50mM乙酸钠pH 5.0中来制备的。在10分钟后，将50μl 1.0M Tris-HCl pH 8.0缓冲液添加至每个孔(包括样品，底物对照，酶对照，试剂对照和标准物)，混合，并立即使用SPECTRAMAX^TM 340PC板读数器(Molecular Devices，Sunnyvale，CA，USA)测定405nm处的吸光度。一个单位的乙酰木聚糖酯酶定义为在pH 5，25℃每分钟能够释放1μmol对硝基苯酚阴离子的酶量。

经脱盐的材料确定为具有每ml样品0.42单位的活性。

实施例8：纯化嗜热毁丝霉CBS 117.65乙酰木聚糖酯酶

使用XK50柱(GE Healthcare，Piscataway，NJ，USA)中的400ml SephadexG-25树脂将重组表达的嗜热毁丝霉乙酰木聚糖酯酶的摇瓶培养液(实施例6)的80ml等分试样缓冲液交换至20mM Tris-HCl pH 8.0中。然后将所得的经缓冲液交换的材料(150ml)使用以20mM Tris-HCl pH 8.0平衡的Mono Q^TM柱(GE Healthcare，Piscataway，NJ，USA)纯化，然后用0-0.5M氯化钠的线性梯度洗脱。如实施例7中所述用乙酸对硝基苯酯测定在280nm处显示UV吸收的级分的酶活性。酶活性在未结合的材料和较早来自柱的级分中观察到，将其全部汇集(220ml)。然后将汇集的材料浓缩并使用具有5kDa分子量截止膜(cut-off membrane)(GE Healthcare，Piscataway，NJ，USA)的VIVASPIN^TM 20超滤浓缩器缓冲液交换至10mM Tris-HCl pH 8.5；终体积为10ml。然后使用经10mM Tris-HCl pH 8.5平衡的MONO Q^TM柱(GE Healthcare，Piscataway，NJ，USA)将经缓冲液交换的、浓缩的9.5ml等分试样纯化，并用0-0.1M氯化钠的线性梯度洗脱。如上所述测定在280nm处显示UV吸收的级分的酶活性。汇集显示最高活性的级分(24ml)，然后使用具有5kDa分子量截止膜(cut-offmembrane)VIVASPIN^TM 20超滤浓缩器浓缩；终体积为3ml。然后使用ECONO-

10DG Desalting Column(Bio-Rad Laboratories，Inc.，Hercules，CA，USA)将3ml浓缩的材料缓冲液交换至含150mM氯化钠的20mMTris-HCl pH 8.0，以产生纯化的嗜热毁丝霉乙酰木聚糖酯酶(4ml)。蛋白质浓度是使用Microplate BCA^TM Protein Assay Kit(Pierce，Rockford，IL，USA)确定的。如上所述对纯化的材料测定活性，其具有0.45单位/mg的比活性。

根据制造商推荐的条件(Bio-Rad Laboratories，Inc.，Hercules，CA，USA)在CRITERION^TM 8-16％Tris-HCl SDS-PAGE凝胶上分离纯化的材料的5ml等分试样。使用PRECISION PLUS PROTEIN^TM All Blue蛋白质标准(Bio-RadLaboratories，Inc.，Hercules，CA，USA)作为分子量标记。将凝胶从盒中移出，并根据制造商推荐的条件(Bio-Rad Laboratories，Inc.，Hercules，CA，USA)用BIO-SAFE^TM Coomassie蛋白质染料染色。在大约22kDa观察到染为深色的条带，并在大约25kDa观察到较浅染色的条带。基于使用ALPHEASEFC^TMSoftware(Alpha Innotech Corporation，San Leandro，CA，USA)计算的凝胶条带密度，22kDa条带为总量的91％而25kDa条带为9％。

实施例9：表征嗜热毁丝霉CBS 117.65乙酰木聚糖酯酶

pH概貌纯化的嗜热毁丝霉乙酰木聚糖酯酶(实施例8)的pH活性概貌是使用乙酸对硝基苯酯作为底物根据实施例7中所述的测定法确定的，只不过在3、4、5、6、7、8和9的pH值使用40mM Britton-Robinson缓冲液(乙酸、磷酸和硼酸各40mM)。

结果显示最大的活性在pH 7观察到。在pH 6和8，分别观察到94％和93％的最大活性。

热稳定性纯化的嗜热毁丝霉乙酰木聚糖酯酶(实施例8)的热稳定性是在50mM乙酸钠pH 5中在温度50℃、60℃和70℃以3小时、1日和3日的间隔确定的。在温育之后，如上针对pH活性概貌所述用乙酸对硝基苯酯作为底物测定其酶活性，只不过测定法在pH 7相对于在4℃储藏了3天的纯化的酶作为参照样品进行。

结果显示，对于每个时间间隔，在50℃和60℃温育的酶样品在温育后相对于参照样品保持了≥95％的活性。在70℃温育3小时的样品保持了其活性的59％，而在70℃温育1日和3日的样品在温育后相对于参照样品分别保持了其11％和2％的活性。

生物材料的保藏

依据布达佩斯条约的条款，下述的生物材料已经保藏于农业研究机构专利培养物保藏中心，亦称农业研究培养物保藏中心(Agricultural ResearchService Patent Culture Collection)，北区研究中心(Northern Regional ResearchCenter)，1815University Street，Peoria，Illinois，61604，并给予下述的登录号：

保藏物                登录号                保藏日期

大肠杆菌pThihe117AXE1 NRRL B-50156          2008年7月24日

所述菌株于下述条件下保藏：确保在本专利申请未决期间，由外国专利法律决定授权的人能够获得所述培养物。所述保藏物为所保藏菌株的基本上纯的培养物。在提交了题述申请的对应申请或其后续申请(progeny)的国家中，依据该外国专利法律的要求，可以获得所述保藏物。然而，应当理解，保藏物的可获得性并不构成对实施题述发明的许可，实施题述发明是对政府行为所授予的专利权的侵犯。

本发明进一步由下述编号的段落描述：

[1]一种具有乙酰木聚糖酯酶活性的分离的多肽，其选自下组：(a)包含与SEQ ID NO：2的成熟多肽具有至少75％同一性的氨基酸序列的多肽；(b)由如下多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸在至少中等-高严格条件下与下述杂交：(i)SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列；(ii)包含于SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列中的cDNA序列；或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；(c)由如下多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸包含与SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列具有至少75％同一性的核苷酸序列；和(d)包含取代、缺失和/或插入一个或多个(几个)氨基酸的SEQ ID NO：2的成熟多肽的变体。

[2]段落1的多肽，其包含与SEQ ID NO：2的成熟多肽具有至少75％同一性的氨基酸序列。

[3]段落2的多肽，其包含与SEQ ID NO：2的成熟多肽具有至少80％同一性的氨基酸序列。

[4]段落3的多肽，其包含与SEQ ID NO：2的成熟多肽具有至少85％同一性的氨基酸序列。

[5]段落4的多肽，其包含与SEQ ID NO：2的成熟多肽具有至少90％同一性的氨基酸序列。

[6]段落5的多肽，其包含与SEQ ID NO：2的成熟多肽具有至少95％同一性的氨基酸序列。

[7]段落6的多肽，其包含与SEQ ID NO：2的成熟多肽具有至少97％同一性的氨基酸序列。

[8]段落1的多肽，其包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列或其具有乙酰木聚糖酯酶活性的片段，或者由SEQ ID NO：2的氨基酸序列或其具有乙酰木聚糖酯酶活性的片段组成。

[9]段落8的多肽，其包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列，或者由SEQ IDNO：2的氨基酸序列组成。

[10]段落8的多肽，其包含SEQ ID NO：2的成熟多肽，或者由SEQ IDNO：2的成熟多肽组成。

[11]段落1的多肽，其由如下多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸在至少中等-高严格条件下与下述杂交：(i)SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列；(ii)包含于SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列中的cDNA序列；或(iii)(i)或(ii)的全长互补链。

[12]段落11的多肽，其由如下多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸在至少高严格条件下与下述杂交：(i)SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列；(ii)包含于SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列中的cDNA序列；或(iii)(i)或(ii)的全长互补链。

[13]段落12的多肽，其由如下多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸在至少非常高严格条件下与下述杂交：(i)SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列；(ii)包含于SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列中的cDNA序列；或(iii)(i)或(ii)的全长互补链。

[14]段落1的多肽，其是由包含与SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列具有至少75％同一性的核苷酸序列的多核苷酸编码的。

[15]段落14的多肽，其是由包含与SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列具有至少80％同一性的核苷酸序列的多核苷酸编码的。

[16]段落15的多肽，其是由包含与SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列具有至少85％同一性的核苷酸序列的多核苷酸编码的。

[17]段落16的多肽，其是由包含与SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列具有至少90％同一性的核苷酸序列的多核苷酸编码的。

[18]段落17的多肽，其是由包含与SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列具有至少95％同一性的核苷酸序列的多核苷酸编码的。

[19]段落18的多肽，其是由包含与SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列具有至少97％同一性的核苷酸序列的多核苷酸编码的。

[20]段落1的多肽，其是由如下多核苷酸编码的，所述多核苷酸包含SEQ ID NO：1的核苷酸序列或其编码具有乙酰木聚糖酯酶活性的片段的亚序列，或由SEQ ID NO：1或其编码具有乙酰木聚糖酯酶活性的片段的亚序列组成。

[21]段落20的多肽，其是由如下多核苷酸编码的，所述多核苷酸包含SEQ ID NO：1的核苷酸序列，或由SEQ ID NO：1的核苷酸序列组成。

[22]段落20的多肽，其是由如下多核苷酸编码的，所述多核苷酸包含SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列，或由SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列组成。

[23]段落1的多肽，其中所述多肽是包含取代、缺失和/或插入一个或多个(几个)氨基酸的SEQ ID NO：2的成熟多肽的变体。

[24]段落1的多肽，其是由包含于质粒pThihe117AXE1中的多核苷酸编码的，所述质粒pThihe117AXE1包含于大肠杆菌NRRL B-50156中。

[25]段落1-24任一项所述的多肽，其中所述成熟多肽为SEQ ID NO：2的氨基酸18到228。

[26]段落1-25任一项所述的多肽，其中所述成熟多肽编码序列为SEQID NO：1的核苷酸52到885。

[27]一种分离的多核苷酸，其包含编码段落1-26任一项所述的多肽的核苷酸序列。

[28]段落27的分离的多核苷酸，其在SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列中包含至少一个突变，其中所述突变核苷酸序列编码SEQ ID NO：2的成熟多肽。

[29]一种核酸构建体，其包含段落27或28的多核苷酸，所述多核苷酸可操作地连接于一个或多个(几个)调控序列，所述调控序列在表达宿主中指导该多肽的产生。

[30]一种重组表达载体，其包含段落29的核酸构建体。

[31]一种重组宿主细胞，其包含段落27或28的多核苷酸，所述多核苷酸可操作地连接于一个或多个(几个)调控序列，其指导具有乙酰木聚糖酯酶活性的多肽的产生。

[32]一种产生段落1-26任一项所述多肽的方法，包括：(a)在有助于该多肽产生的条件下培养细胞，所述细胞以其野生型形式产生该多肽；和(b)回收所述多肽。

[33]一种产生段落1-26任一项所述多肽的方法，包括：(a)在有助于该多肽产生的条件下培养包含核酸构建体的宿主细胞，所述核酸构建体包含编码该多肽的核苷酸序列；和(b)回收所述多肽。

[34]一种产生亲本细胞的突变体的方法，包括破坏或缺失编码段落1-26任一项所述多肽的多核苷酸或其部分，其导致所述突变体与所述亲本细胞相比产生较少的该多肽。

[35]一种突变体细胞，其是由段落34的方法产生的。

[36]段落35的突变体细胞，进一步包含编码天然或异源蛋白质的基因。

[37]一种产生蛋白质的方法，包括：(a)在有助于产生所述蛋白质的条件下培养段落36的突变体细胞；和(b)回收所述蛋白质。

[38]段落27或28所述的分离的多核苷酸，通过下述方法获得：(a)在至少中等-高严格条件下将DNA群体与下述杂交：(i)SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列；(ii)包含于SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列中的cDNA序列；或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；和(b)分离杂交的多核苷酸，其编码具有乙酰木聚糖酯酶活性的多肽。

[39]段落38的分离的多核苷酸，通过下述方法获得：(a)在至少高严格条件下将DNA群体与下述杂交：(i)SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列；(ii)包含于SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列中的cDNA序列；或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；和(b)分离杂交的多核苷酸，其编码具有乙酰木聚糖酯酶活性的多肽。

[40]段落39的分离的多核苷酸，通过下述方法获得：(a)在至少非常高严格条件下将DNA群体与下述杂交：(i)SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列；(ii)包含于SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列中的cDNA序列；或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；和(b)分离杂交的多核苷酸，其编码具有乙酰木聚糖酯酶活性的多肽。

[41]段落38-40任一项所述的分离的多核苷酸，其中所述成熟多肽编码序列为SEQ ID NO：1的核苷酸52到885。

[42]一种产生包含突变体核苷酸序列的多核苷酸的方法，所述突变体核苷酸序列编码具有乙酰木聚糖酯酶活性的多肽，所述方法包括：(a)将至少一种突变导入SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列中，其中所述突变体核苷酸序列编码包含SEQ ID NO：2的成熟多肽或由SEQ ID NO：2的成熟多肽组成的多肽；和(b)回收包含所述突变体核苷酸序列的多核苷酸。

[43]一种由段落42的方法产生的突变体多核苷酸。

[44]一种产生多肽的方法，包括：(a)在有助于所述多肽产生的条件下培养包含编码所述多肽的段落43的突变体多核苷酸的细胞；和(b)回收所述多肽。

[45]一种产生段落1-26任一项所述多肽的方法，包括：(a)在有助于产生所述多肽的条件下培养转基因植物或植物细胞，所述转基因植物或植物细胞包含编码所述多肽的多核苷酸；和(b)回收所述多肽。

[46]一种转基因植物、植物部分或植物细胞，其为使用编码段落1-26任一项所述的多肽的多核苷酸转化的。

[47]一种双链抑制性RNA(dsRNA)分子，其包含段落27或28的多核苷酸的亚序列，其中所述dsRNA任选地为siRNA或miRNA分子。

[48]段落47的双链抑制性RNA(dsRNA)分子，其在长度上为约15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多个双链核苷酸。

[49]一种在细胞中抑制具有乙酰木聚糖酯酶活性的多肽表达的方法，其包括对所述细胞施用或在所述细胞中表达双链RNA(dsRNA)分子，其中所述dsRNA包含段落27或28的多核苷酸的亚序列。

[50]段落49的方法，其中所述dsRNA在长度上为约15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多个双链体核苷酸。

[51]一种编码信号肽的分离的多核苷酸，所述信号肽包含SEQ ID NO：2的氨基酸1至17或由SEQ ID NO：2的氨基酸1至17组成。

[52]一种核酸构建体，其包含编码蛋白质的基因，所述基因可操作地连接于段落51的多核苷酸，其中所述基因对于所述多核苷酸为外源的。

[53]一种重组表达载体，其包含段落52的核酸构建体。

[54]一种重组宿主细胞，其包含段落52的核酸构建体。

[55]一种产生蛋白质的方法，包括：(a)在有助于产生下述蛋白质的条件下，培养下述重组宿主细胞，所述重组宿主细胞包含编码蛋白质的基因，所述基因可操作地连接于段落51的多核苷酸，其中所述基因对于所述多核苷酸是外源的；和(b)回收所述蛋白质。

[56]一种组合物，其包含段落1-26任一项所述的多肽。

[57]一种降解或转化纤维素材料或含木聚糖材料的方法，包括：用酶组合物在段落1-26任一项所述的具有乙酰木聚糖酯酶活性的多肽存在下处理所述纤维素材料或含木聚糖材料。

[58]段落57的方法，其中所述纤维素材料或含木聚糖材料是经预处理的。

[59]段落57或58的方法，其中所述酶组合物包含一种或多种纤维素分解酶，一种或多种木聚糖降解酶，或者一种或多种木聚糖降解酶和一种或多种纤维素分解酶的组合。

[60]段落59的方法，其中所述一种或多种纤维素分解酶选自下组：内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶。

[61]段落59或60的方法，其中所述酶组合物还包含具有纤维素分解增强活性的GH61多肽。

[62]段落59的方法，其中所述一种或多种木聚糖降解酶选自下组：木聚糖酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、木糖苷酶和葡糖醛酸糖苷酶。

[63]段落57-62任一项所述的方法，其中所述酶组合物还包含一种或多种选自下组的酶：半纤维素酶、酯酶、蛋白酶、漆酶和过氧化物酶。

[64]段落57-63任一项所述的方法，还包括回收降解的纤维素材料或含木聚糖材料。

[65]段落64的方法，其中所述降解的纤维素材料或含木聚糖材料是糖。

[66]段落65的方法，其中所述糖选自下组：葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖和阿拉伯糖。

[67]一种产生发酵产物的方法，包括：(a)用酶组合物在段落1-26任一项所述的具有乙酰木聚糖酯酶活性的多肽存在下糖化纤维素材料或含木聚糖材料；(b)用一种或多种发酵微生物发酵经糖化的纤维素材料或含木聚糖材料以产生发酵产物；和(c)自发酵回收发酵产物。

[68]段落67的方法，其中所述纤维素材料或含木聚糖材料是经预处理的。

[69]段落67或68的方法，其中所述酶组合物包含一种或多种纤维素分解酶，一种或多种木聚糖降解酶，或者一种或多种木聚糖降解酶和一种或多种纤维素分解酶的组合。

[70]段落69的方法，其中所述一种或多种纤维素分解酶选自下组：内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶。

[71]段落69或70的方法，其中所述酶组合物还包含具有纤维素分解增强活性的GH61多肽。

[72]段落69的方法，其中所述一种或多种木聚糖降解酶选自下组：木聚糖酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、木糖苷酶和葡糖醛酸糖苷酶。

[73]段落67-72任一项所述的方法，其中所述酶组合物还包含一种或多种选自下组的酶：半纤维素酶、酯酶、蛋白酶、漆酶和过氧化物酶。

[74]段落67-73任一项所述的方法，其中步骤(a)和(b)在同时糖化和发酵中同时进行。

[75]段落67-74任一项所述的方法，其中所述发酵产物是醇、有机酸、酮、氨基酸或气体。

[76]一种发酵纤维素材料或含木聚糖材料的方法，包括：用一种或多种发酵微生物发酵所述纤维素材料或含木聚糖材料，其中所述纤维素材料或含木聚糖材料是用酶组合物在段落1-26任一项所述的具有乙酰木聚糖酯酶活性的多肽存在下糖化的。

[77]段落76的方法，其中发酵所述纤维素材料或含木聚糖材料产生发酵产物。

[78]段落77的方法，还包括从发酵回收发酵产物。

[79]段落76-78任一项所述的方法，其中所述纤维素材料或含木聚糖材料是经预处理的。

[80]段落76-79任一项所述的方法，其中所述酶组合物包含一种或多种纤维素分解酶，一种或多种木聚糖降解酶，或者一种或多种木聚糖降解酶和一种或多种纤维素分解酶的组合。

[81]段落80的方法，其中所述一种或多种纤维素分解酶选自下组：内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶。

[82]段落80或81的方法，其中所述酶组合物还包含具有纤维素分解增强活性的GH61多肽。

[83]段落80的方法，其中所述一种或多种木聚糖降解酶选自下组：木聚糖酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、木糖苷酶和葡糖醛酸糖苷酶。

[84]段落76-83任一项所述的方法，其中所述酶组合物还包含一种或多种选自下组的酶：半纤维素酶、酯酶、蛋白酶、漆酶和过氧化物酶。

[85]段落76-84任一项所述的方法，其中所述发酵产物是醇、有机酸、酮、氨基酸或气体。

在本文中描述和要求保护的发明在范围上并不受本文公开的特定方面所限，这是因为这些方面意欲说明本发明的数个方面。任何等同的方面应在本发明的范围内。事实上，除本文中显示和描述的那些之外，数种对本发明的修改从前述的描述对本领域技术人员将显而易见。这些修改亦意欲落入所附权利要求的范围内。在冲突的情况下，以包括定义的本公开为准。

Claims (20)

1.一种具有乙酰木聚糖酯酶活性的分离的多肽，其选自下组：

(a)包含与SEQ ID NO：2的成熟多肽具有至少75％同一性的氨基酸序列的多肽；

(b)由如下多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸在至少中等-高严格条件下与下述杂交：(i)SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列；(ii)包含于SEQ IDNO：1的成熟多肽编码序列中的cDNA序列；或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；

(c)由如下多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸包含与SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列具有至少75％同一性的核苷酸序列；和

(d)包含取代、缺失和/或插入一个或多个(几个)氨基酸的SEQ ID NO：2的成熟多肽的变体。

2.权利要求1的多肽，其包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列或其具有乙酰木聚糖酯酶活性的片段，或由SEQ ID NO：2的氨基酸序列或其具有乙酰木聚糖酯酶活性的片段组成。

3.权利要求1的多肽，其由包含于质粒pThihe117AXE1中的多核苷酸编码，所述质粒pThihe117AXE1包含于大肠杆菌NRRL B-50156中。

4.一种分离的多核苷酸，其包含编码权利要求1-3任一项所述的多肽的核苷酸序列。

5.一种重组宿主细胞，其包含权利要求4的多核苷酸，所述多核苷酸可操作地连接于一个或多个(几个)调控序列，所述调控序列指导具有乙酰木聚糖酯酶活性的多肽的产生。

6.一种产生权利要求1-3任一项所述多肽的方法，包括：(a)在有助于该多肽产生的条件下培养细胞，所述细胞以其野生型形式产生该多肽；和(b)回收所述多肽。

7.一种产生权利要求1-3任一项所述多肽的方法，包括：(a)在有助于该多肽产生的条件下培养包含核酸构建体的宿主细胞，所述核酸构建体包含编码该多肽的核苷酸序列；和(b)回收所述多肽。

8.一种产生亲本细胞突变体的方法，包括破坏或缺失编码权利要求1-3任一项所述多肽的多核苷酸或其部分，其导致所述突变体与所述亲本细胞相比产生较少的该多肽。

9.一种产生权利要求1-3任一项所述多肽的方法，包括：(a)在有助于产生所述多肽的条件下培养转基因植物或植物细胞，所述转基因植物或植物细胞包含编码所述多肽的多核苷酸；和(b)回收所述多肽。

10.一种转基因植物、植物部分或植物细胞，其是用编码权利要求1-3任一项所述的多肽的多核苷酸转化的。

11.一种双链抑制性RNA(dsRNA)分子，其包含权利要求4的多核苷酸的亚序列，其中所述dsRNA任选地为siRNA或miRNA分子。

12.一种在细胞中抑制具有乙酰木聚糖酯酶活性的多肽表达的方法，包括对所述细胞施用或在所述细胞中表达双链RNA(dsRNA)分子，其中所述dsRNA包含权利要求4的多核苷酸的亚序列。

13.一种编码信号肽的分离的多核苷酸，所述信号肽包含SEQ ID NO：2的氨基酸1至17，或由SEQ ID NO：2的氨基酸1至17组成。

14.一种产生蛋白质的方法，包括：(a)在有助于所述蛋白质产生的条件下培养重组宿主细胞，所述细胞包含可操作地连接于权利要求13的多核苷酸的编码蛋白质的基因，其中所述基因对于所述多核苷酸是外源的；和(b)回收所述蛋白质。

15.一种降解或转化纤维素材料或含木聚糖材料的方法，包括：在权利要求1-3任一项所述的具有α-葡糖醛酸糖苷酶活性的多肽存在下用酶组合物处理所述纤维素材料或含木聚糖材料。

16.权利要求15的方法，还包括回收降解的纤维素材料或含木聚糖材料。

17.一种产生发酵产物的方法，包括：

(a)在权利要求1-3任一项所述的具有α-葡糖醛酸糖苷酶活性的多肽存在下用酶组合物糖化纤维素材料或含木聚糖材料；

(b)用一种或多种发酵微生物发酵经糖化的纤维素材料或含木聚糖材料以产生所述发酵产物；和

(c)自所述发酵回收发酵产物。

18.一种发酵纤维素材料或含木聚糖材料的方法，包括：用一种或多种发酵微生物发酵所述纤维素材料或含木聚糖材料，其中所述纤维素材料或含木聚糖材料是在权利要求1-3任一项所述的具有α-葡糖醛酸糖苷酶活性的多肽存在下用酶组合物糖化的。

19.权利要求18的方法，其中所述纤维素材料或含木聚糖材料的发酵产生发酵产物。

20.权利要求19的方法，还包括从所述发酵回收所述发酵产物。

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